Abstract

fundal

Microbiomul intestinal are un rol important în sănătatea sugarului și în dezvoltarea imunitară și poate fi afectat de expuneri la începutul vieții. Dieta maternă poate influența microbiomul intestinal al sugarului prin transferul vertical al microbilor materni la sugari în timpul nașterii vaginale și alăptării. Ne-am propus să examinăm asocierea dietei materne în timpul sarcinii cu microbiomul intestinal al sugarului la 6 săptămâni după naștere în diadele mamă-sugar înscrise în New Hampshire Birth Cohort Study. Probele de scaun pentru sugari au fost colectate de la 145 de sugari, iar dieta prenatală maternă a fost evaluată folosind un chestionar privind frecvența alimentelor. Am folosit secvențierea țintită a regiunii hipervariabile 16S rRNA V4-V5 pentru a caracteriza microbiota intestinului infantil. Pentru a ține cont de diferențele în linia de bază și traiectoriile profilurilor microbiene intestinale ale sugarului, am stratificat analizele în funcție de modul de livrare.

Rezultate

Am identificat trei grupuri de microbiomi intestinali infantili, caracterizați prin abundență crescută de Bifidobacterium, streptococ și Clostridium, și Bacteroides, respectiv, în ansamblu și în stratul infantil livrat vaginal. În analizele stratificate la sugari născuți vaginal și ajustate pentru alți potențiali confundători, aportul de fructe materne a fost asociat cu structura comunității microbiene intestinale a sugarului (PERMANOVA, p

fundal

Studiile au examinat contribuția maternă la sănătatea sugarului, inclusiv efectul dietei materne în timpul sarcinii și alăptării. Dieta prenatală influențează riscul de alergie la sugari și copii. De exemplu, dieta mediteraneană în timpul sarcinii a fost asociată cu un risc redus de respirație șuierătoare și atopică persistentă și atopică la copiii cu vârsta de 6,5 ani [1, 2]. Consumul ridicat de carne în timpul sarcinii este asociat cu un risc crescut de respirație șuierătoare în primul an de viață, în timp ce aportul de lactate materne este asociat cu un risc redus de respirație șuierătoare infantilă [2]. Se știe puțin despre mecanismele reale prin care dieta maternă afectează sănătatea copiilor; facem ipoteza că dieta maternă are impact asupra dezvoltării microbiomului intestinal în copilărie și ulterior influențează rezultatele asupra sănătății copilului. S-a stabilit că dieta este un factor important al microbiomului intestinal. S-a dovedit că dietele pe termen scurt, compuse exclusiv din alimente vegetale sau animale, modifică microbiomul intestinal uman [3]. În plus, studiile efectuate pe oameni și șoareci gnotobiotici umanizați arată că dietele cu carbohidrați reduși [4] sau cu conținut ridicat de polizaharide modifică compoziția microbiomului intestinal [5].

Până în prezent, a existat o investigație limitată a relației dietei materne cu dezvoltarea microbiomului intestinal al sugarului. Un studiu a observat că dieta maternă bogată în grăsimi în timpul sarcinii a fost asociată cu compoziția microbiană a meconiului, dar a avut date limitate despre dieta maternă [6]. Un mecanism pe care microbiomul intestinal al sugarului poate fi afectat de dieta maternă este prin transferul vertical al microbilor materni la sugari la naștere. Există o relație bine stabilită a microbiomului intestinal al sugarului cu modul de livrare (operație cezariană versus sugari născuți vaginal) [7, 8], care poate persista până la vârsta adultă [9]. Alternativ, dieta maternă poate afecta dezvoltarea fetală și răspunsul ulterior al gazdei la populațiile microbiene la și după naștere. În plus, diferențele în compoziția laptelui matern datorate dietei materne pot contribui la microbiomul intestinal al sugarului la sugarii alăptați. Am examinat relația dietei materne în timpul sarcinii cu microbiomul scaunului sugarului la sugarii de 6 săptămâni și am identificat asociații în cadrul grupurilor de mod de naștere.

Rezultate

Populația de studiu

Caracteristicile populației studiate sunt rezumate în Tabelul 1 (n = 145). Vârsta maternă a variat între 22 și 44 de ani, cu o medie de 31,9 ani. Mai mult de 70% dintre mamele din populație aveau cel puțin o diplomă universitară, mai mult de 90% erau căsătorite, iar majoritatea erau mame pentru prima dată. Fumatul în timpul sarcinii a fost rar, la 4,8%, iar populația a fost ușor supraponderală, cu un IMC mediu înainte de sarcină de 25,6. Populația noastră avea mai mulți sugari de sex masculin decât sugarii de sex feminin (57,2% bărbați) și o greutate medie la naștere și o vârstă gestațională de 3427 g și, respectiv, 39,3 săptămâni. Majoritatea sugarilor s-au născut vaginal (66,9%) și au fost alăptați exclusiv (70,3%) la vârsta de 6 săptămâni. Prezența la îngrijirea copilului și expunerea la antibiotice pentru sugari la vârsta de 4 luni sau înainte au fost rare. Măsurătorile și distribuția dietei prenatale materne sunt prezentate în Tabelul 1. Majoritatea caracteristicilor subiectului și factorii dietetici materni nu au fost diferite între grupurile de mod de livrare (Tabelul 1).

Compoziția comunității microbiene și factorii dietetici materni

Am identificat 11.029.093 secvențe bacteriene în 145 de probe de scaun pentru sugari de 6 săptămâni, trecând controlul calității. Cel mai abundent grup taxonomic a fost Enterobacteriaceae cuprinzând 20,0% din microbiomul de scaun pentru sugari de 6 săptămâni, urmat de Bifidobacterium (18,4%), Bacteroides (10,4%) și streptococ (8,10%) (Fișier suplimentar 1: Tabel S1). Recoltarea OTU cu referință deschisă a identificat un total de 4260 OTU în populația noastră de probe de scaun pentru sugari de 6 săptămâni, cu 2850 OTU corespunzătoare ID-urilor Greengenes și 1410 OTU de novo. Principalele noastre analize s-au concentrat pe sugarii născuți vaginal (n = 97). Ajustarea pentru metoda de hrănire a sugarului, IMC matern, paritate și lot, consumul de fructe materne a fost asociat cu compoziția microbiomului scaunului pentru sugari (distanță generalizată UniFrac PERMANOVA, p = 0,028; Masa 2; FIG. 1a). Într-o analiză de sensibilitate, efectul consumului de fructe materne asupra microbiomului intestinal al sugarilor la bebelușii născuți vaginal a persistat atunci când este limitat la sugarii care au fost alăptați exclusiv (distanța generalizată UniFrac PERMANOVA, p = 0,022; masa 2). Cu excepția sugarilor care ar fi putut primi antibiotice sau a celor administrați prematur (Fișa suplimentară 1: Tabelul S10, Figura S7a), nu s-au modificat calitativ rezultatele.

maternă

Clustere de microbiomi intestinali pentru sugari

Am identificat trei clustere distincte ale microbiomului intestinal al sugarului la sugarii născuți vaginal (n = 97), cu clusterul 1 caracterizat printr-o abundență mare a genului Bifidobacterium, grupul 2 după genuri streptococ și Clostridium, și grupul 3 de gen Bacteroides (Fișier suplimentar 1: Figura S1, Tabelul S1). Pentru a evalua relația dintre factorii dietetici materni și apartenența la clusterul intestinal al sugarului, am folosit regresia logistică multinomială cu clusterul 1 ca grup de referință. Cotele de apartenență la grupul 2 sunt de 2,73 ori mai mari pentru fiecare porție suplimentară maternă de fructe pe zi (IÎ 95% 1,36, 5,46; Tabelul 3, Fig. 1b). Aceste rezultate au fost consecvente atunci când sugarii născuți prematur nu au fost incluși în analize (Fișa suplimentară 1: Tabelul S9, Figura S6a).

Unități taxonomice operaționale în intestinul sugarului și factori dietetici materni

Asociații la sugari născuți prin cezariană

Discuţie

Am observat diferențe atât în ​​structura comunității microbiene intestinale infantile globale, cât și în microbi specifici în raport cu factorii alimentari materni, adesea într-un model dependent de modul de livrare. Unele efecte ale dietei materne au fost mai evidente la sugarii alăptați exclusiv; cu toate acestea, nu am putut să ne comparăm cu sugarii hrăniți exclusiv cu formulă, deoarece majoritatea sugarilor au primit niște lapte matern.

În mai multe cazuri, un factor alimentar matern a fost asociat cu un microb în ambele grupuri de naștere, dar în direcții opuse. Deoarece livrarea prin cezariană are ca rezultat structura diferențială a comunității microbiene a intestinului sugarului [24], iar microbiomul intestinal este un sistem complex, astfel de diferențe sunt plauzibile; vor fi necesare studii experimentale pentru a confirma această observație. Cu toate acestea, asocierile dintre dieta maternă și comunitățile microbiene ale intestinului sugarului nu au diferit întotdeauna în funcție de modul de livrare. De exemplu, scorul aMED matern a fost în mod consecvent asociat pozitiv și negativ cu Enterobacteriaceae familie și, de asemenea, asociat negativ cu specia Escherichia coli, în ambele straturi ale modului de livrare.

Eșantionul nostru de studiu a fost extras din nordul New England, care are o populație relativ omogenă; acest lucru ar putea limita generalizabilitatea studiului. Cu toate acestea, prin limitarea confuziei nemăsurate datorită diferențelor de microbiomi umani între populații care pot duce la asocieri eronate cu diferențe alimentare, studiul nostru poate avea, de asemenea, o validitate internă mai mare. Dieta maternă a fost evaluată prin auto-raportare între 24 și 28 de săptămâni de gestație și este posibil ca tiparele dietetice să se schimbe aproape de sfârșitul sarcinii sau în timpul alăptării. Cu toate acestea, dietele sunt adesea stabile, iar un chestionar de evaluare a frecvenței alimentelor la jumătatea sarcinii (FFQ) este probabil să fie suficient de reprezentativ pentru sarcina târzie și dieta de alăptare într-o proporție mare de indivizi [25, 26]. Cu toate acestea, efectele pe care le observăm se pot datora parțial dietei materne în timpul alăptării. Mai mult decât atât, nu putem concluziona dacă efectele dietei materne apar doar la copiii alăptați sau, de asemenea, la cei cu hrana preponderent hrănită sau cu o combinație de formulă și lapte matern. De asemenea, este posibil ca asocierile dintre expunerile materne și microbiota sugarului la 6 săptămâni de viață să fie influențate de factori neinvestigați în acest studiu.

Studiile viitoare care examinează relația dintre dieta maternă și componentele laptelui matern, inclusiv profilurile microbiene și nutriționale, precum și influența potențială a dietei materne asupra microbiomului fetal, pot oferi o perspectivă asupra mecanismelor prin care dieta maternă influențează microbiomul intestinal al sugarului. Determinarea impactului modificărilor în microbiomul intestinal al sugarilor din cauza dietei materne asupra sănătății și dezvoltării sugarului este o oportunitate de a rafina recomandările dietetice pentru femeile gravide și care alăptează pentru a sprijini sănătatea sugarului.

Concluzii

În concluzie, am identificat trei grupuri de comunități microbiene ale intestinului sugarului și am observat efectele multiplilor factori dietetici materni prenatali asupra microbiomului intestinului infantil, care variau adesea în funcție de modul de livrare.

Metode

Populația de studiu

Subiecții pentru prezentul studiu au fost din New Hampshire Birth Cohort Study (NHBCS) care au furnizat probe de scaun pentru sugari la 6 săptămâni postpartum. După cum sa descris anterior [27, 28], participanții eligibili pentru NHBCS sunt femeile însărcinate care beneficiază de îngrijire prenatală în clinicile din New Hampshire, SUA, care au raportat că se bazează pe un puț privat, nereglementat, ca sursă de apă de acasă. Participanții între 18 și 45 de ani au fost recrutați între 24 și 28 de săptămâni de gestație. Centrul pentru Protecția Subiecților Umani de la Dartmouth a oferit aprobarea comisiei de revizuire instituțională. Toate metodele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare. S-a obținut consimțământul informat în scris pentru participarea tuturor subiecților pentru ei și copiii lor. Între 31 martie 2011, când primul subiect potențial cu posibilitatea de a colecta un eșantion de scaun pentru sugari de 6 săptămâni a fost selectat pentru eligibilitate și 30 iunie 2015, când datele au fost înghețate pentru această analiză, 6569 femei au fost selectate pentru eligibilitate și 1334 au fost eligibile. Nouă sute șaptezeci și șase de subiecți au fost înrolați și 361 au furnizat probe de scaun pentru sugari de 6 săptămâni, dintre care 187 aveau date de secvențiere a genei 16S rRNA disponibile (Fișier suplimentar 1: Figura S2).

Interviurile telefonice efectuate la fiecare 4 luni au constatat metoda de hrănire a sugarului, inclusiv momentul încetării alăptării și data de începere a fiecărei noi formule, după caz, precum și utilizarea medicamentelor, cum ar fi antibioticele. S-a raportat că sugarii nu au fost introduși niciodată în formulă și că au fost alăptați la sân au fost considerați exclusiv alăptați, în timp ce cei care au fost alăptați vreodată și care au fost hrăniți cu formulă au fost considerați hrăniți cu o combinație de lapte matern și formulă, indiferent dacă sugarul era încă alăptat la momentul colectării scaunului. Cei care nu au fost alăptați niciodată și au primit doar formule au fost considerați exclusiv hrăniți cu formule. Modul de livrare a fost extras din înregistrările maternale, iar înălțimea, greutatea și paritatea pre-sarcină materne au fost determinate printr-un chestionar autoadministrat la intrarea în studiu și utilizate pentru a calcula IMC înainte de sarcină.

Date dietetice materne și scor dietetic mediteranean

Dieta maternă în timpul sarcinii a fost evaluată în timpul săptămânilor gestaționale 24-28 cu un chestionar validat de frecvență a alimentelor (FFQ) [25]. Am calculat scorul dietei mediteraneene alternative (aMED) pe baza măsurilor derivate din FFQ ale consumului zilnic de alimente, urmând metoda Tobias și colab. 2012 [29], excluzând consumul de alcool pentru a adapta scorul la o cohortă însărcinată. Consumul zilnic de legume, fructe, leguminoase, soia și nuci, cereale integrale, pește și fructe de mare și raportul monoinsaturat până la grăsimi saturate (MUFA: SFA) peste mediană este considerat sănătos și conferă 1 punctaj scorului aMED. Aportul de carne roșie și procesat este considerat mai puțin sănătos, iar consumul sub median conferă 1 punctaj scorului aMED. Acest lucru duce la posibile valori ale scorului aMED de la 0 la 7, cu un scor mai mare care indică o aderență mai mare la un model dietetic mediteranean. Am luat în considerare în plus fiecare dintre aceste componente dietetice și lactatele materne, acizii grași polinesaturați (PUFA) și acizii grași omega-3 acid eicosapentaenoic (EPA) și acid docosahexaenoic (DHA).

Colectarea probelor și extracția ADN-ului

Probele de scaun pentru sugari au fost colectate la ședința maternă post-partum de 6 săptămâni și au fost alicotate și congelate la - 80 ° C în decurs de 24 de ore. Urmând metodele stabilite revizuite de Wu și colab. [30], am folosit kitul de extracție ADN Zymo (Zymo Research) pentru a extrage ADN microbian din probele decongelate și am cuantificat ADN-ul folosind OD260/280 nanodrop.

Secvențierea genei ARNr 16S țintită

Regiunea hipervariabilă V4-V5 a genei bacteriene 16S rRNA a fost secvențiată la Laboratorul biologic marin (MBL) din Woods Hole, MA, folosind metode stabilite [31, 32]. După cum s-a descris anterior [24], ampliconii 16S rDNA V4-V5 au fost generați din probe de ADN genomic purificate folosind primerii de fuziune. Utilizarea grundurilor directe care conțin unul dintre cele opt coduri de bare cu cinci nucleotide între puntea specifică Illumina și regiunile de grund de secvențiere și regiunea specifică 16S și un grund invers unic care conține 1 din 12 indici Illumina permite 96 de probe pe banda de multiplexare. Amplificările au fost făcute în triplicat cu un control negativ pentru controlul intern al calității la MBL. Am folosit qPCR (Kapa Biosystems) pentru a cuantifica grupul de ampliconi și un ciclu Illumina MiSeq 500 alăturat pentru a secvența fiecare grup de 96 de biblioteci. Am demultiplexat și împărțit seturi de date folosind Illumina MiSeq Reporter și un script Python personalizat.

Profilarea microbiomului

Pentru a identifica profilurile structurii populației microbiene, am folosit secvențe de amplicon de lungime completă pentru regiunile hipervariabile ale genei rRNA V4-V5. Am combinat citirile înainte și invers pe baza suprapunerii secvenței [33], am eliminat secvențele primer și am eliminat secvențele care conțin orice nucleotide ambigue. Am folosit vsearch [34] pentru a elimina himerele atât de novo, cât și în comparație cu referința de formare a clasificatorului RDP.

Prelucrarea datelor și analiza statistică

Am identificat unități taxonomice operaționale de referință deschisă (OTU) folosind versiunea QIIME 1.9.1 [35] cu algoritmul UCLUST și 97% similaritate [36]. Am folosit alinierea PyNAST [37] cu referința de bază Greengenes [38, 39] pentru a construi tabele OTU și a atribui taxonomie [39, 40]. Arborii filogenetici au fost construiți folosind metoda FastTree [41]. Analizele ulterioare au fost efectuate folosind versiunea R 3.2.2 [42]. Am calculat distanțele generalizate UniFrac între perechi de probe folosind tabele OTU și arborele filogenetic înrădăcinat în mijloc. UniFrac generalizat unifică UniFrac ponderat și neponderat pentru a detecta diferențele în linii moderat abundente în loc de cele exclusiv în linii extrem de abundente sau rare [43, 44]. Din 187 de probe de scaun pentru sugari cu date disponibile de secvențiere, am scăzut 18 pentru lipsa datelor materne FFQ, 14 pentru lipsa metodei de hrănire a sugarului și 7 pentru lipsa IMC matern. Am scăpat trei mostre de calitate scăzută, cu număr de citiri