Shugo Hosoda

1 Divizia de Stomatologie Estetică și Cariologie Clinică, Departamentul de Stomatologie Conservatoare, Școala de Stomatologie a Universității Showa, Ohta-ku, Tokyo 145-0062, Japonia; pj.ca.u-awohs.tned@adosoh (S.H.); moc.ssiteneger@abihs (T.S.); pj.ca.u-awohs.tned@ebanama (A.M.)

Yumi Kawazoe

2 RegeneTiss Inc., Okaya, Nagano 394-0046, Japonia; moc.ssiteneger@eozawak

3 Divizia de Toxicologie, Departamentul de Farmacologie, Toxicologie și Terapie, Școala de Farmacie a Universității Showa, Shinagawa-ku, Tokyo 142-8555, Japonia

Toshikazu Shiba

1 Divizia de Stomatologie Estetică și Cariologie Clinică, Departamentul de Stomatologie Conservatoare, Școala de Stomatologie a Universității Showa, Ohta-ku, Tokyo 145-0062, Japonia; pj.ca.u-awohs.tned@adosoh (S.H.); moc.ssiteneger@abihs (T.S.); pj.ca.u-awohs.tned@ebanama (A.M.)

2 RegeneTiss Inc., Okaya, Nagano 394-0046, Japonia; moc.ssiteneger@eozawak

Satoshi Numazawa

3 Divizia de Toxicologie, Departamentul de Farmacologie, Toxicologie și Terapie, Școala de Farmacie a Universității Showa, Shinagawa-ku, Tokyo 142-8555, Japonia

4 Centrul de cercetare farmacologică, Universitatea Showa, Shinagawa-ku, Tokyo 142-8555, Japonia

Atsufumi Manabe

1 Divizia de Stomatologie Estetică și Cariologie Clinică, Departamentul de Stomatologie Conservatoare, Școala de Stomatologie a Universității Showa, Ohta-ku, Tokyo 145-0062, Japonia; pj.ca.u-awohs.tned@adosoh (S.H.); moc.ssiteneger@abihs (T.S.); pj.ca.u-awohs.tned@ebanama (A.M.)

Date asociate

Abstract

Stratul de semințe de Ginkgo este rar folosit și este de obicei aruncat, datorită mirosului său ofensator și a toxicității sale. Oțetul de ginkgo este un produs fermentat din stratul de semințe de ginkgo, iar fermentația elimină mirosul urât și cea mai mare parte a toxicității. Astfel, oțetul de ginkgo conține concentrații foarte mici de componente toxice. Prezentul studiu a examinat efectul anti-obezitate al oțetului de ginkgo la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi și inhibarea adipogenezei în celulele 3T3-L1. Oțetul de Ginkgo a suprimat creșterea în greutate corporală indusă de dietă bogată în grăsimi și a redus dimensiunea celulelor adipoase la șoareci. Oțetul de Ginkgo a suprimat expresia C/EBPδ și PPARγ, proteine ​​cheie în adipogeneză și a inhibat acumularea de lipide în celulele 3T3-L1 care au fost induse să devină adipocite. Aceste rezultate au sugerat că oțetul de ginkgo a inhibat diferențierea adipocitelor. Pe de altă parte, o concentrație corespunzătoare de acid acetic a avut un efect semnificativ mai mic asupra acumulării de lipide și practic niciun efect asupra expresiei genei adipogene. Aceste rezultate au sugerat că, similar cu extractul de Ginkgo biloba, oțetul de ginkgo ar putea preveni și îmbunătăți adipozitatea. Prin urmare, stratul de semințe de ginkgo ar putea fi un material util pentru ingredientele medicinale.

1. Introducere

Ginkgo biloba este adesea plantat pe străzile orașelor din întreaga lume, deoarece este extrem de rezistent la poluarea aerului, cum ar fi gazele de eșapament ale mașinilor și are caracteristici excelente de rezistență la foc. Cu toate acestea, există plângeri continue cu privire la mirosul neplăcut al straturilor de semințe de ginkgo, care cad pe stradă și provoacă poluarea mirosurilor. În plus, stratul extern de semințe al Ginkgo biloba conține acid ginkgolic și substanțe înrudite, care sunt foarte alergenice [1], iar aportul excesiv de semințe de ginkgo duce la otrăvirea ginkgotoxinei, care provoacă spasme tonice clonice, vărsături și pierderea cunoștinței, 3]. Prin urmare, în ciuda faptului că stratul de semințe de ginkgo este bogat în nutriție, carnea, care reprezintă aproximativ 75% până la 80% din stratul de semințe de ginkgo, este aruncată împreună cu semințele [4]. Deoarece Ginkgo biloba a fost desemnată ca specie pe cale de dispariție [5], o alternativă mai bună ar fi utilizarea eficientă a stratului de semințe ofensator, mai degrabă decât plantarea doar a copacilor masculi pentru a evita duhoarea.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale

Oțetul de Ginkgo a fost furnizat de Ginkgo Vinegar Research Institute, Inc. (Koshigaya, Japonia). Ginkgolide B și bilobalide au fost achiziționate de la Nagara Science Inc. (Gifu, Japonia). Concentrația de acid acetic în oțet de ginkgo a fost calculată la 5,0%, determinată prin cromatografie ionică (Dionex ICS-5000 cu o coloană de schimb de anioni AS20).

2.2. Animale

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul instituției universitare Showa (numărul permisului 26045). Șoareci masculi C57BL/6 (6 săptămâni) au fost cumpărați de la Japan SLC Co., Ltd. (Hamamatsu, Japonia). Au fost aclimatizați mediului timp de 1 săptămână cu o dietă standard de chow (F2, Sankyo Labo Service Corp., Tokyo, Japonia). Șoarecii au fost apoi împărțiți în mod aleatoriu în cinci grupuri. Patru grupuri de șoareci au fost hrăniți cu HFD, unde grăsimile cuprindeau 60% din conținutul caloric (New Brunswick, NJ, SUA) și un grup a fost hrănit cu o dietă standard de chow (n = 5 per grup). Șoarecii au primit acces ad libitum la alimente și apă, care conțineau 0%, 2,5%, 5,0% sau 7,5% oțet de ginkgo, timp de 10 săptămâni. Șoarecii au fost cântăriți de două ori pe săptămână.

2.3. Analiza histochimică

Țesutul adipos epididimal a fost disecat și fixat în soluție de formalină tamponată neutră 10%. Țesuturile grase au fost încorporate în parafină și tăiate în secțiuni. Secțiunile au fost supuse colorării hematoxilinei/eozinei (HE), conform protocolului standard. Imaginile histologice ale țesutului adipos au fost achiziționate cu un microscop (Keyence BZ-8100, Kyoto, Japonia). Suprafața medie acoperită de 50-60 adipocite a fost calculată cu software-ul Image J.

2.4. Cultură de celule

Celulele 3T3-L1 au fost obținute de la JCRB Cell Bank (Osaka, Japonia) și crescute în mediul Eagle modificat (DMEM) al Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) și antibiotice. Celulele (1,0 × 104 celule/godeu) au fost crescute într-o placă cu 24 de godeuri timp de 2 zile până la confluență (ziua 0). Apoi, mediul a fost schimbat cu mediu de inducție (MDI; DMEM cu 10% FBS, 0,5 mM 3-izobutil-1-metilxantină, 1 μM dexametazonă și 10 μg/mL insulină). După o incubare de 2 zile, mediul a fost schimbat cu un mediu de întreținere (DMEM cu 10% FBS și 10 μg/ml insulină), iar celulele au fost incubate timp de 6 zile.

2.5. Evaluarea citotoxicității și diferențierii

Celulele 3T3-L1 (4,0 × 104 celule/godeu) au fost însămânțate pe microplăci cu 96 de godeuri, au fost lăsate să se atașeze timp de 24 de ore și tratate cu oțet de ginkgo pentru încă 24 de ore. Citotoxicitatea a fost evaluată cu testul Kit de numărare a celulelor-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonia). Pentru a evalua diferențierea adipogenă, celulele au fost fixate cu 10% formalină timp de 10 minute și clătite de două ori cu apă distilată. Celulele au fost apoi spălate cu 60% izopropanol timp de 1 min și colorate cu 3 mg/ml ulei roșu O dizolvat în izopropanol timp de 20 min. Celulele colorate au fost spălate o dată cu 60% izopropanol și de două ori cu PBS. Uleiul Roșu O a fost extras din celulele colorate prin adăugarea de 1 ml de izopropanol 100% și celule balansoare ușor timp de 5 minute. Extractele de izopropanol au fost transferate pe o placă cu 96 de godeuri, iar absorbanța a fost măsurată la 492 nm cu un cititor de microplăci.

2.6. Western Blotting

Celulele 3T3-L1 au fost cultivate într-o placă cu 24 de godeuri, spălate cu PBS și recoltate cu 200 ofL de tampon de probă (2% SDS, 5% 2-mercaptoetanol, 10% glicerol, 0,0005% albastru de bromofenol, 62,5 mM Tris, pH 6.8). Probele au fost electroforizate pe un gel SDS-poliacrilamidă 10%, iar proteinele au fost transferate la o membrană PVDF. Membrana a fost blocată timp de 1 oră cu 0,2% bloc I (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, SUA). Membrana a fost sondată cu un anticorp primar: anti-PPARγ (1: 10.000; E-8, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, SUA) sau anti-C/EBPδ (1: 10.000; C-6, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, SUA) peste noapte la 4 ° C. Membrana a fost spălată cu 20 mM Tris, pH 7,4, 137 mM NaCI, 3 mM KCl și 0,1% Tween 20 (TTBS) timp de 10 minute, de 5 ori, apoi incubată cu un anticorp secundar adecvat timp de 1 oră la temperatura camerei. După spălarea cu TTBS timp de 10 minute de 5 ori, benzile proteice au fost detectate cu un sistem convențional de chemiluminescență (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SUA). Nivelurile de expresie a proteinelor au fost analizate cu un ImageQuant LAS 4000 mini (GE, Healthcare, Chicago, IL, SUA).

2.7. PCR în timp real

ARN total a fost extras din celule 3T3-L1 cu un mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). Transcrierea inversă a fost efectuată cu ARN total (100-200 ng) și trusa de transcripție inversă cADN de mare capacitate (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). PCR cantitativă a fost efectuată pe un termociclor ABI 7500 Fast (Applied Biosystems) cu sistemul de testare a expresiei genei TaqMan (C/EBPδ, Mm00786711_s1; PPARγ, Mm00440940_m1).

2.8. Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate cu un ANOVA unidirecțional, urmat de testul de comparații multiple al lui Tukey, cu excepția cazului în care se specifică altfel.

3. Rezultate

3.1. Efectul supresiv al oțetului Ginkgo asupra creșterii în greutate la șoareci

Pentru a testa dacă șoarecii nu erau dispuși să bea oțet de ginkgo, am măsurat consumul de apă potabilă care conținea diferite concentrații de oțet de ginkgo. Am observat că consumul de apă a scăzut pe măsură ce concentrația de oțet de ginkgo a crescut la peste 10%. Pe de altă parte, cu 7,5% sau mai puțin oțet de ginkgo, șoarecii au prezentat un consum constant, echivalent cu consumul de apă simplă (Figura S1). Consumul de apă potabilă cu oțet de ginkgo nu sa schimbat semnificativ timp de cel puțin o săptămână. Prin urmare, am folosit 2,5%, 5,0% și 7,5% oțet de ginkgo în apa de băut în următoarele experimente in vivo. Aceste concentrații de oțet de ginkgo au fost calculate ca fiind 0,12 ml, 0,25 ml și 0,37 ml ca aport zilnic, respectiv.

S-a raportat anterior că GbE a atenuat obezitatea indusă de HFD, boala hepatică grasă nealcoolică, ateroscleroza și diabetul zaharat la animale [16,17,18]. Pentru a investiga dacă oțetul de ginkgo a avut un efect similar cu cel al GbE asupra creșterii în greutate, șoarecii au fost hrăniți cu HFD și au băut apă cu 2,5%, 5,0% sau 7,5% oțet de ginkgo. O creștere semnificativă a greutății corporale pe parcursul întregii perioade a experimentului a fost observată la grupurile cu HFD comparativ cu grupul cu dieta normală. Creșterea în greutate indusă de HFD a fost în mod semnificativ suprimată de 7,5% oțet de ginkgo după 31 de zile și de 2,5% și 5,0% oțet de ginkgo după 45 de zile, comparativ cu animalele care au băut apă fără oțet de ginkgo. Mai mult, oțetul de ginkgo a suprimat creșterea în greutate la șoarecii alimentați cu HFD într-un mod dependent de concentrație (Figura 1 A).

oțetului

3.2. Efectul oțetului Ginkgo asupra diferențierii in vitro a adipocitelor

Pentru a examina dacă oțetul de ginkgo și acidul acetic au prezentat efecte inhibitorii asupra diferențierii adipocitelor, celulele 3T3-L1 au fost tratate cu 0,4% oțet de ginkgo și 0,02% acid acetic în cursul diferențierii adipocitelor induse cu mediu MDI. Atât oțetul de ginkgo, cât și acidul acetic au redus colorarea cu ulei-roșu a O a adipocitelor diferențiate (Figura 2 A). Cu toate acestea, oțetul de ginkgo a inhibat diferențierea adipocitelor mai profund decât concentrația corespunzătoare de acid acetic (Figura 2 B).