Efectele gilaburu (Viburnum opulus) suc pe tumoare ascită Ehrlich indusă experimental la șoareci

viburnum

Dilek Ceylan 1, Ahmet Aksoy 2, Tolga Ertekin 3, Arzu Hanım Yay 4, Mehtap Nisari 3, Gökçe kereker Karatoprak 5, Harun Ülger 3
1 Centrul de genom și celule stem, Universitatea din Erciyes, Kayseri, Turcia
2 Departamentul de Biologie, Școala de Arte și Științe, Universitatea din Akdeniz, Antalya, Turcia
3 Departamentul de Anatomie, Facultatea de Medicină, Universitatea din Erciyes, Kayseri, Turcia
4 Departamentul de histologie și embriologie, Facultatea de Medicină, Universitatea din Erciyes, Kayseri, Turcia
5 Departamentul de farmacognoză, Școala de farmacie, Universitatea din Erciyes, Kayseri, Turcia

Data publicării web8 martie 2018

adresa de corespondenta:
Dr. Dilek Ceylan
Centrul de genom și celule stem, Universitatea din Erciyes, Kayseri 38039
Curcan

Sursa de asistență: Nici unul, Conflict de interese: Nici unul

5

DOI: 10.4103/0973-1482.181173

Obiectiv: Scopul studiului a fost investigarea efectului anticancer al Viburnum opulus (VO) pe carcinomul ascitei Ehrlich (EAC) care poartă șoareci tratați cu diferite concentrații de VO.
Materiale și metode: Pentru transplant de tumori; șoarecii au fost inoculați cu 1 × 106 celule EAC intraperitoneal și apoi au fost împărțiți în cinci grupuri (n = 9). Două ore după inoculare; grupurile experimentale au fost tratate zilnic cu extract de VO la doze de 1000 mg/kg, 2000 mg/kg, 4000 mg/kg.
Rezultate: Extractele obținute din sucul de gilaburu pot avea un efect mai dificil asupra creșterii celulelor tumorale.
Concluzie: Din câte știm, acesta este primul studiu despre in vivo activitatea antitumorală a modelului tumorii ascitei VOon Ehrlich și, în consecință, extractul VO a prezentat activitate anticanceroasă împotriva șoarecilor purtători de EAC.

Cuvinte cheie: Activitate antitumorală, tumoră ascită Ehrlich, cancer experimental, histopatologie, Viburnum opulus


Cum se citează acest articol:
Ceylan D, Aksoy A, Ertekin T, Yay AH, Nisari M, Karatoprak G &, Ülger H. Efectele gilaburu (Viburnum opulus) suc pe tumoare ascită Ehrlich indusă experimental la șoareci. J Can Res Ther 2018; 14: 314-20

Cum se citează această adresă URL:
Ceylan D, Aksoy A, Ertekin T, Yay AH, Nisari M, Karatoprak G &, Ülger H. Efectele gilaburu (Viburnum opulus) suc pe tumoare ascită Ehrlich indusă experimental la șoareci. J Can Res Ther [serial online] 2018 [citat 22 decembrie 2020]; 14: 314-20. Disponibil de pe: https://www.cancerjournal.net/text.asp?2018/14/2/314/181173

De trei secole, mai ales transplantate cu substanțe cancerigene chimice și modele de tumori spontane au apărut în cercetarea experimentală a cancerului. Aceste modele au fost preferate frecvent, deoarece pot fi aplicate și, de asemenea, produse mai ușor în centrele de cercetare. [21] În ultimele 2-3 decenii, studiile asupra cancerului care poate fi transplantat au crescut numeroase. Tumora Ehrlich a fost descrisă inițial ca un adenocarcinom mamar murin spontan. Este un carcinom în creștere rapidă, cu un comportament foarte agresiv și poate crește în aproape toate tulpinile de șoareci. [22], [23] A fost folosit ca model tumoral transplantabil pentru a investiga efectele antineoplasice ale mai multor compuși chimici. După inocularea intraperitoneală a celulelor tumorale Ehrlich, volumul ascitic și numărul de celule cresc drastic. [24] Scopul acestui studiu a fost de a investiga proprietățile antitumorale ale diferitelor concentrații de extract de pulbere de suc de gilaburu pe ambele in vitro folosind celule tumorale Ehrlich și in vivo folosind modelul tumorilor Ehrlich de ascită murină.

Material vegetal și prepararea extractului

Ciorchinele cu fructe de VO au fost colectate de la Kayseri din Turcia în octombrie 2011. Ciorchinele cu fructe au fost combinate și ambalate în pungi de plastic. Tulpinile au fost îndepărtate și fructele au fost zdrobite cu un băț de sticlă. Masa a fost centrifugată la calibru 6000 timp de 20 de minute. Supernatantul sucului limpede a fost turnat în sticle de sticlă. După extractele centrifugate din fructe au fost liofilizate cu uscător congelator Labconco (model 117-A65312906; FreeZone 2.5) timp de 24 de ore și apoi depozitate în flacoane de plastic la -80 ° C până la analiză. În ziua analizei, extractul de VO a fost sterilizat cu filtru de 0,45 și 0,20 μm în care soluție salină tampon de fosfat steril (PBS).

Animale experimentale

Toate procedurile și protocoalele experimentale pentru animale au fost aprobate de Comitetul de etică a animalelor experimentale, Universitatea Erciyes, Turcia (12/89-12/08/2012). În total, 45 de șoareci Balb/c de aproximativ 6-8 săptămâni, cu o greutate corporală medie de 25-30 g, au fost achiziționați de la Unitatea Animalelor de Laborator din Centrul de Cercetări Experimentale și Clinice, Universitatea Erciyes și găzduiți sub condiționare controlată (25 ± 1 ° C temperatura constantă, 55% umiditate relativă, 12 ore cicluri de întuneric/lumină). Hrana și apa erau permise ad libitum în perioada de studiu. Șoarecii au fost aclimatizați la condițiile de laborator timp de 7 zile înainte de începerea experimentului.

Celulele tumorale

Animal de origine care are carcinom pentru ascită Ehrlich (EAC) obținut de la Departamentul de Biologie al Facultății de Științe, Universitatea Gaziantep. EAC este un cancer de sân spontan murin care a servit ca tumoare originală din care a fost obținută o variantă de ascită. Celulele tumorale au fost menținute în laboratorul nostru prin trecere serială intraperitoneală (i.p.) la șoareci masculi Balb/c la interval de 7-10 zile. Celulele EAC au fost testate pentru viabilitate și contaminare utilizând tehnica de excludere a colorantului albastru trypan. S-a constatat întotdeauna că viabilitatea celulară este de 95% sau mai mult. Suspensiile de celule tumorale au fost preparate în PBS. [25]

Programul de transplant și tratament al tumorilor

Șoarecii au fost inoculați cu 1 × 106 celule EAC (0,2 ml/șoarece) i.p. Ziua de implantare a tumorii a fost atribuită ca ziua „0.” La două ore după inoculare, animalele au fost randomizate și împărțite în cinci grupuri (n = 9). Grupurile de control și experimentale au fost după cum urmează:

  • Grupa 1: grup de control negativ (n = 9); PBS a fost injectat i.p. zilnic timp de 10 zile
  • Grupul 2: grup de control pozitiv (n = 9); 1 × 106 celule EAC au fost injectate i.p. iar PBS a fost injectat i.p. zilnic timp de 10 zile
  • Grupa 3: n = 9; 1 × 106 celule EAC au fost injectate i.p., iar apoi animalele au fost tratate zilnic cu extract de VO la o doză de 25 mg (1000 mg/kg) i.p. să fie în limita a 200 μL PBS timp de 10 zile
  • Grupa 4: n = 9; 1 × 106 celule EAC au fost injectate i.p., iar apoi animalele au fost tratate zilnic cu extract de VO la o doză de 50 mg i.p. (2000 mg/kg) să fie în limita a 200 μL PBS timp de 10 zile
  • Grupa 5: n = 9; 1 × 106 celule EAC au fost injectate i.p., iar apoi animalele au fost tratate zilnic cu extract de VO la o doză de 100 mg i.p. (4000 mg/kg) să fie în limita a 200 μL PBS timp de 10 zile.

Dozele au fost selectate pe baza unui studiu anterior realizat în laboratorul nostru. [19] Toate animalele au fost sacrificate la 11 zile, 24 de ore după ultima doză și lichidul de ascită a fost colectat din cavitatea peritoneală a grupurilor 2-5 pentru evaluarea creșterii tumorale. Efectele anticanceroase ale VO au fost testate prin observarea schimbării în ceea ce privește greutatea corporală zilnică, numărul de celule tumorale viabile și neviabile în cavitatea peritoneală a grupurilor tratate și a grupului de control. După sacrificiu, țesuturile hepatice și renale au fost îndepărtate și examinate pentru a stabili parametrii biochimici. În plus, am examinat histologic țesuturile hepatice, renale, de colon și ale intestinului subțire pentru a evalua efectul inhibitor al tumorii al extractului VO.

In vitro studiu

Pentru in vitro citotoxicitate, celulele EAC au fost utilizate pentru a studia citotoxicitatea extractului de VO după ce au fost colectate din cavitatea peritoneală a șoarecilor purtători de tumori. 5 × 105 celule EAC au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri în mediu RPMI 1640 suplimentat cu ser fetal bovin 10% și incubate la 37 ° C în incubator 5% CO2 timp de 24 de ore. După 24 de ore de incubație în mediul de creștere, celulele au fost expuse la diferite volume de VO (125, 250, 500 μg/ml) care s-au sterilizat cu filtru de 0,45 și 0,20 μm, timp de 48 de ore. După 48 ore suspensie celulară și o soluție de albastru tripan a fost amestecat 1: 1 și viabilitatea celulelor a fost estimată folosind un hemocitometru. Citotoxicitatea a fost calculată ca număr de celule viabile peste numărul de celule totale și a fost prezentată ca procent de citotoxicitate.

Evaluarea parametrilor biochimici

Enzimele antioxidante au fost evaluate în țesuturile hepatice și renale colectate de la animale experimentale după excizie. După clătire de două ori în tampon, țesuturile au fost cântărite și omogenizate cu un omogenizator de teflon în volume măsurate de tampon fosfat (pH 7,4). Omogenatul a fost centrifugat la 10.000 rpm timp de 10 minute și supernatantul a fost utilizat pentru analiză. Nivelurile substanțelor reactive ale acidului tiobarbituric (TBARS) în țesuturile hepatice și renale au fost măsurate așa cum sa raportat. [26] Nivelurile de peroxizi lipidici (TBARS) au fost exprimate ca μmoli de malondialdehidă (MDA)/g de țesuturi hepatice și renale. Superoxidul dismutază (SOD) a fost analizat conform metodelor descrise de Sun [27] activitatea catalazei (CAT) a fost efectuată conform metodei propuse de Aebi. [28]

Evaluarea parametrilor histopatologici

Probele de țesuturi au fost fixate în formalină neutră tamponată 10% (pH 7,2) la temperatura camerei. După fixare, țesuturile au fost deshidratate prin soluții gradate de alcool și încorporate în parafină. Secțiunile (5 μm grosime) au fost colorate cu hematoxilină și eozină și examinate la microscopul cu lumină (Zeiss Axiolab) pentru analiză histopatologică.

analize statistice

Conformitatea cu distribuția normală a datelor și omogenitatea varianței au fost evaluate prin testul Shapiro-Wilk și respectiv Levene. Comparațiile între grupuri au fost evaluate utilizând testele Kruskal-Wallis H și analiza varianței unidirecționale. Comparații multiple au fost evaluate prin testele Tamhan T2 și Siegel-Castell. Analizele datelor au fost evaluate utilizând programe comerciale IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM Inc., Chicago, IL, SUA) și nivelul de semnificație a fost asumat aproximativ P a și a 75-a percentilă).

Activitatea anticancerigenă a extractului de VO împotriva șoarecilor purtători de EAC a fost evaluată cu parametri ca modificări ale greutății corporale și număr de celule viabile și neviabile. După grupul de control al tumorii, creșterea maximă în greutate a fost observată în grupa 3, unde cea mai mică creștere în greutate a fost observată în grupa 5 dintre grupurile experimentale. Sa constatat că greutatea tumorii a crescut semnificativ în grupul de control EAC în comparație cu alte grupuri care au fost tratate cu VO (P Tabelul 1: Variația medie a greutății în grupurile de control și experiment

În a 11-a zi, lichidul de ascită a fost colectat din cavitatea peritoneală a grupurilor experimentale și de control al tumorii. Rata de supraviețuire a celulelor tumorii ascitei Ehrlich (EAT) a fost raportată a fi 100% viabilitate în grupa 2. Pentru celelalte grupuri (grupurile 3-5), acest indice sa dovedit a fi de 88,72%, 69,02% și respectiv 51,87% [Tabelul 2 ]. Viabilitatea% în grupul purtător de EAC în comparație cu grupurile experimentale a scăzut semnificativ în grupurile 4 și 5 (P Tabelul 2: Numărul de celule viabile și procentul de viabilitate în grupurile de control și experiment

În test pentru in vitro citotoxicitate, citotoxicitatea extractului VO a fost evaluată în celulele EAC utilizând testul de excludere a albastrului tripan după 48 de ore de expunere în cultură. Valoarea IC50 a fost determinată ca 199,58 μg/ml. Cea mai mică concentrație de extract de VO (199,58 μg/ml) a avut un efect semnificativ asupra morții celulare deoarece procentul de celule viabile a fost redus la 50% comparativ cu grupul martor. Procentul de celule viabile a scăzut odată cu creșterea concentrației de extract de VO. S-a constatat că peste 79% din celule sunt moarte la concentrația de 500 μg/ml [Tabelul 3]. În grupul de control al cancerului, comparativ cu grupurile experimentale, sa constatat că citotoxicitatea a crescut semnificativ în toate cele trei grupuri tratate cu VO (P Tabelul 3: Efectul de citotoxicitate al Viburnum opulus pe grupuri de control și experiment

Constatări biochimice

Constatări histologice

Țesut tumoral

Țesuturi hepatice

Țesuturi renale

Colon și țesuturile intestinului subțire

Recent, a fost folosit în compoziția dietetică naturală cu agenți de chimioterapie în terapia cancerului. Multe publicații au raportat că aceste diete conțin flavonoide și compuși fenolici care sunt asociați cu inhibarea cancerului. Compușii fenolici au efecte anticanceroase care sunt asociate cu proprietățile lor antioxidante, antiinflamatorii. Polifenolii, atunci când sunt administrați înainte sau în timpul tratamentului cancerigen, sunt eficienți în prevenirea cancerului. Modelele tumorale transplantate pot fi relevante pentru terapia cu polifenolici. [29] Modelul EAC care a fost transplantat este foarte agresiv și specific pentru șoareci. Astfel, EAC este un model tumoral convenabil pentru a evalua efectele anticanceroase ale extractului de VO. Studiile anterioare legate de VO au raportat că are antioxidanți, [10] eliminarea radicalilor puternici datorită concentrației fenolice mari a tuturor extractelor. [15]

Într-un studiu recent, au fost investigate efectele sucului de gilaburu (VO) asupra tumorogenezei colonului. Tumorile colonice experimentale au fost induse de 1,2-dimetilhidrazină (DMH), subcutanată o dată pe săptămână timp de 12 săptămâni. Grupurile de tratament au primit suc de gilaburu timp de 30 de săptămâni (au început cu prima injecție cu DMH) și timp de 18 săptămâni (au început după ultima injecție cu DMH). Locurile și incidența leziunilor tumorale (displazie de grad scăzut, displazie de grad înalt, carcinom intramucosal și carcinom invaziv) au fost analizate și comparate cu martorul. A existat o reducere a numărului total mediu de leziuni tumorale în grupurile de tratament în comparație cu grupul de control al cancerului. Acest studiu a fost raportat că sucul de gilaburu ar putea preveni progresul tumorilor stabilite, dar nu ar putea preveni inducerea chimică a tumorilor colonice la șoareci. [19]

Se raportează că joacă un rol important al radicalilor derivați de oxigen în etiologia dezvoltării cancerului. [33] Acești radicali liberi care au capacitate mutagenă apar ca urmare a interacțiunii dintre moleculele chimice care sunt foarte reactive și ADN. [34]

Protecția celulelor împotriva daunelor oxidative se realizează prin sisteme antioxidante enzimatice sau neenzimatice. Țesuturile hepatice și renale au antioxidanți care previn deteriorarea cauzată de excesul de metaboliți ai oxigenului. Acești antioxidanți neutralizează atât peroxizii, cât și radicalii liberi. [35] MDA, produsul final al peroxidării lipidelor, a avut loc în timpul descompunerii degenerative a țesutului canceros, este un biomarker al stresului oxidativ care a prezentat niveluri mai ridicate în țesuturile canceroase în comparație cu țesuturile normale. [36] Se știe că activitatea acestei enzime crește atunci când este compusă din stres oxidant, inclusiv cancer, cu un mecanism adaptativ. [37] Rezultatele prezentului studiu, nivelurile de MDA la șoarecii purtători de EAC s-au găsit mai mari decât grupurile tratate, dar această creștere nu a fost semnificativă statistic.

CAT este o peroxidază care s-a transformat în apă și oxigen folosind H2O2 ca substrat. Superoxidul este transformat în peroxid de hidrogen de către enzima SOD. [36] Este bine cunoscut faptul că celulele prezintă mecanisme antioxidante enzimatice, cum ar fi generarea de SOD și CAT, care sunt implicate în eliminarea radicalilor liberi. SOD și CAT sunt implicate în eliminarea superoxidului și a peroxidului de hidrogen. Cercetătorii au raportat că nivelurile scăzute de activitate SOD au fost detectate la șoarecii purtători de EAC ca răspuns la pierderea activității Mn 2+ -SOD și a mitocondriilor din celulele EAC, rezultând o scădere a cantității de activitate SOD totală în ficat. [38], [39], [40] A fost raportată și inhibarea activității SOD și CAT ca o consecință a creșterii tumorii. [41]

Rezultate similare au fost găsite în studiul nostru pe grupul de control EAC. Activitatea CAT și SOD a scăzut la nivelul țesuturilor hepatice și renale la șoarecii martori purtători de EAC în comparație cu grupul martor normal. Nivelurile de activitate CAT și SOD au crescut într-o manieră dependentă de doză spre niveluri normale la tratamentul cu extract de VO. Scăderea activităților SOD și CAT și creșterea nivelurilor de MDA ar putea fi considerate ca fiind agresive ale radicalilor liberi rezultate din dezvoltarea cancerului. Cu toate acestea, se consideră că este transformat radicalii liberi în produse mai stabile sau stimulează enzimele antioxidante direct din cauza includerii cantității de compuși antioxidanți ai extractului de VO compuși fenolici particulari.

Aceste rezultate au fost susținute de constatări histopatologice la ficat, rinichi, colon și țesuturile intestinului subțire ale șoarecilor purtători de EAC și la șoarecii cu extract de VO administrat. Constatările histopatologice în controlul EAC și în grupurile tratate au fost observate cu histologie hepatică normală. Prin urmare, metastaza nu a fost observată în ficat. Acest efect este probabil legat de conținutul VOextract. Cu toate acestea, s-a observat că agregarea celulelor tumorale în celelalte țesuturi ale grupului de control EAC. Pe de altă parte, grupurile experimentale tratate cu VO au arătat că s-au diminuat modificările patologice datorate caracteristicilor antioxidante ale VO care au fost citotoxice față de celulele EAC. Conform acestor constatări patologice, a existat o inhibare a tumorii în toate grupele date cu extract de VO, comparativ cu șoarecii purtători de EAC.

Din câte știm, am raportat in vitro și in vivo activitatea antitumorală a modelului VOon EAT pentru prima dată.

Extractul de VO a prezentat activitate antitumorală împotriva EAC prin modularea peroxidării lipidelor și creșterea sistemelor endogene de apărare antioxidantă. Sunt necesare studii viitoare pentru a investiga care compuși au fost eficienți și responsabili pentru activitatea antitumorală a extractului de VO.

Mulțumiri

Autorii doresc să mulțumească profesorului Mehmet Özaslan, Departamentul de Biologie, Universitatea Gaziantep, Turcia pentru furnizarea celulelor EAC.