Finanțat de o subvenție din partea Consiliului danez pentru cercetare în științe naturale.

vinclozolinului

Mark Bayley, Peter Foged Larsen, Henrik Bækgaard, Erik Baatrup, The Effects of Vinclozolin, an Anti-Androgenic Fungicide, on Male Guppy Secondary Sex Characters and Reproductive Success, Biology of Reproduction, Volume 69, Issue 6, 1 December 2003, Pages 1951 –1956, https://doi.org/10.1095/biolreprod.103.017780

Abstract

În ciuda volumului enorm de cercetări referitoare la diferitele efecte ale substanțelor chimice cu proprietăți perturbatoare endocrine la pești, există încă foarte puține dovezi că perturbarea endocrină poate afecta negativ fertilitatea individuală și, prin urmare, poate pune probleme populației. În studiul de față, gupii (Poecilia reticulata) au fost hrăniți cu fungicidul anti-androgen vinclozolin la concentrații cuprinse între 1,8 și 180 mg/kg de la 8 la 14 săptămâni. Numărul de spermatozoizi masculini și intensitatea comportamentului său de afișare sexuală au fost reduse semnificativ în grupurile de tratament, ceea ce a fost în concordanță cu rezultatele studiilor anterioare. Aici, arătăm în continuare că aceste deficiențe se traduc în fertilitate redusă, măsurată ca mărime a primului ambreiaj al femelei. De asemenea, această fertilitate redusă a fost corelată cu numărul de spermatozoizi masculi, dar nu cu intensitatea afișării sexuale masculine. În cele din urmă, prin încrucișarea expuse cu animale neexpuse, arătăm că efectul advers al vinclozolinului asupra reproducerii este mediat doar prin mascul.

Introducere

În ultimul deceniu s-au înregistrat cercetări intensive asupra posibilelor efecte ale substanțelor chimice care perturbă endocrinul (EDC) asupra oamenilor și faunei sălbatice. Cele mai bine stabilite exemple de perturbare endocrină au fost găsite în mediul acvatic, ceea ce nu este deloc surprinzător, deoarece acesta este destinatarul final pentru multitudinea de EDC suspectate, atât din surse casnice, cât și din surse industriale [1]. Într-adevăr, mediul marin găzduiește cel mai bun (și poate singurul) exemplu stabilit de EDC care provoacă pierderea efectivă a fecundității și a scăderii populației, cu efectele tri-butil-staniu asupra comunităților de moluște [2, 3]. Majoritatea studiilor privind efectele EDC asupra vieții sălbatice acvatice au fost efectuate pe pești. Bărbații prezintă o serie de semne de feminizare, inclusiv niveluri crescute de vitellogenină [4], dezvoltare testiculară retardată [5], număr redus de spermatozoizi [6-8] și comportament reproductiv anormal [6, 7, 9, 10]. Efectele asupra femelelor au fost considerabil mai puțin studiate, dar au apărut rapoarte despre populațiile de pești cu tendințe masculine lângă fabricile de celuloză care pot fi cauzate de masculinizarea femelelor [11-13]. În plus, au apărut numeroase rapoarte privind intersexul într-o varietate de specii de pești, în care țesutul clar identificabil de la ambele sexe se găsește în gonada unui individ (pentru revizuire, a se vedea [1]).

În ciuda acestor numeroase efecte ale EDC asupra peștilor, de la nivel molecular la țesut și organ, foarte puține dovezi susțin orice efecte directe ale acestor substanțe chimice asupra fertilității individuale, care ar putea indica un declin grav al populației în viitor. În laborator, reproducerea peștilor a fost redusă de hormoni sexuali sau analogii lor farmaceutici [14-16], octil fenol [14-17], inhibitorul aromatazei fadrozol [18] și pesticida metoxiclor, despre care se știe că are estrogen proprietăți [14]. Cu toate acestea, aceste studii de laborator au găsit doar dovezi ale succesului reproductiv redus la cele mai mari concentrații testate și două dintre aceste studii au remarcat că efectele asupra reproducerii au necesitat expunerea la o concentrație de peste opt ori mai mare, provocând efecte la niveluri mai scăzute de organizare biologică, cum ar fi vitelogeneza sau histologie [15, 16]. Datele de teren care indică efectele perturbării endocrine asupra fertilității peștilor sunt chiar mai rare, doar un singur studiu arătând o corelație pozitivă între incidența ovotestelor și fertilitatea masculină redusă [1].

Scopul prezentului studiu a fost, în primul rând, de a determina dacă efectele vinclozolinului asupra caracteristicilor sexuale secundare ale masculului guppy se traduc în efecte dăunătoare asupra reproducerii și, în al doilea rând, să încerce să distingă influențele paterne și materne asupra oricărei posibile reduceri a reproducerii.

Materiale și metode

Animale experimentale și acvarii

Animalele experimentale au fost guppi de tip sălbatic (P. reticulata) originari din Columbia în 1997 și de atunci au fost întreținuți la laboratorul nostru în acvarii de 500 litri din oțel inoxidabil. Aceste acvarii au fost menținute la 25 ± 2 ° C și au primit apă dintr-un rezervor aerisit care conține un amestec de apă deionizată, produs printr-un sistem de osmoză inversă și apă de la robinet fără clor la un raport de 5: 1. Mai mult, s-au adăugat 450 mg apă de rezervor de NaCl/L, rezultând un pH de 7,3 și o conductivitate constantă de 600 μS/cm. Această apă a fost utilizată în toate acvariile descrise mai jos. Populația de animale a fost hrănită zilnic cu artemie recent eclozionată și hrană comercială pentru pești (TetraMinRubin, TetraMin și TetraPhyla; Tetra Werke, Melle, Germania).

Trei experimente au fost efectuate în prezentul studiu pentru a distinge efectele reproductive ale vinclozolinului (Riedel-de-Haen AG, Seelze, Germania) mediate prin efecte asupra fenotipului sexual masculin de efectele asupra femeilor înainte de inseminare și efectele exercitate în timpul sarcinii. În primele două dintre aceste experimente, indivizii nou eclozați au fost scoși zilnic din refugiile acvariilor stocate și plasate într-un acvariu din sticlă fără sudură de 80 litri (laboratorul Struers KEBO A/S, Copenhaga, Danemarca) care conține un borcan plin cu pietriș apa a fost reciclată. Acești tineri au fost observați zilnic pentru prima apariție a caracteristicilor sexuale, moment în care au fost separați prin sex în două acvarii identice, dar mai mici (25 L), permițând colectarea femelelor virgine pentru experimentare, ceea ce a fost necesar deoarece guppy poate reține sperma pentru o serie de ambreiaje dintr-o singură împerechere [23].

Expunerea la Vinclozolin

În toate cele trei experimente, gupii au fost expuși la vinclozolin prin alimentele lor folosind acetonă ca solut purtător în soluții stoc. S-au preparat alimente care conțin 0,1, 1,0 sau 10,0 μg de vinclozolin/mg de alimente uscate. Alimentele pentru controale au fost preparate în același mod folosind numai acetonă. În timpul expunerii, gupii au primit în medie 18 mg furaj uscat per gram de pește (începe greutatea umedă) pe zi, rezultând doze nominale medii de 1,8, 18 și 180 mg vinclozolin/kg. Greutatea medie de început a fost determinată prin eliminarea aleatorie a 10 pești din fiecare grup de masculi și femele virgine și femele gravide.

Experimentul de expunere feminină virgină

Șaptezeci și cinci de femele virgine (vârsta, 10 săptămâni) au fost alese aleatoriu din acvariul feminin virgin și 15 au fost plasate în fiecare dintre cele cinci acvarii de sticlă fără sudură (34,5 × 29 × 28 cm) conținând apă la o adâncime de 15 cm și un pietriș borcan de filtrare așa cum este descris mai sus. Două dintre aceste acvarii erau controale; peștii din restul de trei acvarii au primit 0,1, 1,0 și respectiv 10,0 μg de vinclozolin/mg de hrană uscată, respectiv, timp de 30 de zile, timp în care fecalele și alimentele nemâncate au fost îndepărtate zilnic prin aspirație. În acest moment, peștii erau distribuiți în grupuri de trei pești din același tratament în 23 de acvarii de sticlă fără sudură (28,5 × 20 × 22 cm) care conțin apă la o adâncime de 7 cm, un borcan cu filtru de pietriș și o plasă din oțel inoxidabil refugiu (diametru, 8 cm) astfel încât toate acvariile să conțină trei femele virgine. Opt dintre aceste acvarii au servit drept controale, în timp ce toate celelalte tratamente au fost reproduse de cinci ori. După o zi de aclimatizare, a fost adăugat un bărbat adult din acvariul timp de 7 zile pentru inseminare, după care a fost îndepărtat masculul adult. Aceste acvarii au fost monitorizate de trei ori pe zi timp de 45 de zile pentru descendenții nou eclozați, care au fost îndepărtați pentru a evita canibalismul adulților.

Experiment de expunere la femeile însărcinate

Femelele adulte, complet crescute, au fost scoase aleatoriu din acvariile de stoc și plasate în grupuri de trei în 23 de acvarii de sticlă fără sudură, așa cum este descris mai sus. Opt dintre aceste acvarii au servit drept controale; toate celelalte tratamente (care au primit 0,1, 1,0 și respectiv 10,0 μg de vinclozolin/mg de alimente uscate, respectiv) au fost reproduse de cinci ori. Expunerea a fost continuată timp de 45 de zile, timp în care acvariile au fost monitorizate de trei ori pe zi pentru descendenții nou eclozați, care au fost îndepărtați pentru a evita canibalismul adulților. Fecalele și alimentele nemâncate au fost îndepărtate zilnic prin aspirație.

Experiment de expunere masculină

După cele 7 zile cu femele, intensitatea comportamentului de curte masculină a acestor 23 de bărbați a fost măsurată individual față de o femeie adultă, însărcinată. Femelele însărcinate au fost alese deoarece nu sunt receptive la încercările copulatorii ale bărbaților [24], maximizând astfel consistența răspunsului feminin. Două femele au fost utilizate alternativ pentru toți masculii. În urma acestei înregistrări a comportamentului sexual al bărbatului, a fost efectuat un număr de spermatozoizi la fiecare dintre bărbați.

Procedura de numărare a spermei

Masculul a fost ușor anesteziat într-o soluție apoasă de 200 μg/ml de etil-4-aminobenzoat (Sigma-Aldrich, Vallensboek Strand, Danemarca) timp de aproximativ 1 min și așezat ușor pe o placă de sticlă curată. Gonopodiul a fost tachinat cu atenție la un unghi de 70 ° (relativ la suprafața abdominală) și s-au adăugat 10 μl de 175 mM KCl în unghiul dintre gonopod și corpul peștilor. Guppy a fost dezbrăcat de spermă conform metodei descrise de Toft și Baatrup [24], iar spermatozoizii au fost numărați în conformitate cu liniile directoare generale pentru numărarea spermei umane [25].

Cuantificarea comportamentului de curte masculină

Gupii bărbați adulți normali sunt extrem de activi în curtarea femelelor, realizând un model de înot foarte stereotip și caracteristic față de femelele adulte, de multe ori mai mult de o dată pe minut în timpul zilei. Acest model de înot, care este denumit comportament sigmoid datorită adoptării de către bărbat a formei caracteristice a corpului tensionat, asemănător cu litera greacă sigma în timpul curtei, a fost intens studiat și descris în detaliu [26]. Datorită naturii sale stereotipate, a fost posibil să se dezvolte software-uri computerizate de analiză a imaginii (DISPLAY ver 3.01; Institutul de Științe Biologice, Universitatea din Aarhus, Danemarca) capabil să recunoască acest comportament din secvențe video [6].

O femeie complet crescută, nereceptivă, a fost plasată într-un acvariu din sticlă fără sudură (28,5 × 20 × 22 cm), care a fost suflat cu nisip pentru a elimina reflexiile, conținând 3 cm de apă din acvariul de rezervă. Această apă a fost aleasă din cauza prezenței suspectate de feromoni eliberați în timpul nașterii, care sunt stimulatoare pentru comportamentul de curte masculin [27, 28]. Femelele nereceptive au fost alese pentru a maximiza similitudinea răspunsului feminin la diferiți bărbați în timpul măsurării. Guppii femele adulte sunt receptivi la copulație timp de 3 zile după ce au născut o mulțime de tineri [29], iar femelele nereceptive pot fi alese din stoc găsind indivizi evident gravizi. Bărbatul a fost plasat în acvariu pentru o perioadă de aclimatizare de 15 minute înainte de a înregistra comportamentul de curte timp de 10 minute.

Comportamentul de curte a celor 23 de bărbați a căror capacitate de reproducere a fost măsurată așa cum a fost descris mai sus a fost cuantificată în acest mod. Datorită experienței noastre cu variații mari în acest punct final, cauzată parțial de bărbați ocazionali din toate grupurile care nu au reușit să îndeplinească comportamentul de curte în timpul perioadei de înregistrare, comportamentul de curte a altor 36 de bărbați tratați identic (15 bărbați de control și 7 bărbați în fiecare grup de expunere) a fost cuantificat.

Analize statistice

Diferențele dintre grupurile de tratament pentru toți parametrii au fost testate folosind ANOVA unidirecțional. Când s-au detectat diferențe de tratament, diferențele dintre controale și tratamentele cu vinclozolin au fost testate folosind testul Dunnett post-hoc cu software SPSS (SPSS pentru Windows, versiunea 10.0; SPSS, Inc., Chicago, IL). În cazul comportamentului de curte, diferențele dintre cele două grupuri de bărbați (experiment cu 23 de bărbați și, ulterior, cu 36 de bărbați) au fost testate folosind testul Mann-Whitney. Deoarece nu s-a detectat nicio diferență semnificativă între aceste grupuri (P = 0,398), datele au fost reunite pentru analize ulterioare. Corelațiile dintre producția reproductivă și comportamentul sexual sau numărul de spermatozoizi au fost investigate folosind testul de corelație Pearson.

Rezultate

Reproducere

Nu a fost observată nicio mortalitate în niciunul dintre tratamente în timpul experimentării. Expunerea bărbaților tineri adulți la cele mai mari doze de vinclozolin timp de 30 de zile a avut un efect negativ semnificativ (F3,19 = 4,22, P = 0,019) asupra dimensiunii primului ambreiaj produs de femelele virgine neexpuse pe care le-au inseminat. Mai mult, efectul vinclozolinului a urmat un model standard de doză-răspuns (Fig. 1a). Astfel, bărbații necontaminați au generat, în medie, 3,3 descendenți pe femelă și bărbații expuși la cea mai mică doză generată de 2,4 descendenți pe femelă (nu diferă semnificativ de martori). Cu toate acestea, grupul expus la doze intermediare și mari, generat de 1.4 și 1.1 descendenți la femelă, respectiv. Spre deosebire, expunerea femeilor tinere și virgine la vinclozolin, care au fost ulterior împerecheate cu bărbați neexpusi, a dus la o ușoară reducere a dimensiunii primului ambreiaj și în niciun caz ambreiajele acestor femele expuse nu au fost semnificativ mai mici (F3,19 = 0,294, P = 0,829) decât cele ale controalelor (Fig. 1b). În mod similar, nu s-a observat niciun efect semnificativ al tratamentului (F3,19 = 1.407, P = 0.272) la ambreiajele produse în timpul expunerii gravide (Fig. 1c).

Efectele expunerii dietetice la vinclozolin asupra reproducerii guppy-ului prezentate ca dimensiunea medie a primului ambreiaj feminin. A) Expunerea gupilor masculi între 10 și 14 săptămâni are un efect dăunător asupra dimensiunii primului ambreiaj după copulația cu femele virgine. b) Expunerea femelelor virgine între 10 și 14 săptămâni nu are niciun efect semnificativ asupra dimensiunii primului ambreiaj. c) Expunerea femeilor adulte gravide nu are niciun efect semnificativ asupra primului ambreiaj după încetarea expunerii. Barele de eroare arată SEM. Pentru toate cele trei experimente, n = 8 pentru controale și 5 pentru tratamente. Barele de eroare arată SEM. * P Fig. 2). Astfel, bărbații de control au produs o ejaculare care conține în medie 3,02 milioane de celule de spermă, care la bărbații cărora li s-a administrat cea mai mare doză de vinclozolin a fost redusă cu aproape două treimi (la 1,06 milioane de spermatozoizi). În plus față de această reducere a numărului de spermatozoizi în ejacularea masculilor expuși la vinclozolin, o proporție ridicată a spermatozoizilor masculi expuși a fost imobilă, rezultat care, din păcate, nu a fost cuantificat.

Expunerea orală la vinclozolin de la 10 la 14 săptămâni determină o reducere semnificativă a numărului de spermatozoizi masculi. Numărul de spermatozoizi a fost efectuat la bărbați individuali după ce au fost ținuți cu femela lor virgină desemnată pentru fertilizare timp de 7 zile și măsurarea ulterioară a comportamentului lor sexual. Barele de eroare arată SEM. ** P 2 = 0,162, P = 0,033) a fost găsit între numărul de spermatozoizi și numărul de tineri produși ulterior de femelele inseminate (Fig. 3).

Numărul de spermatozoizi masculi este corelat semnificativ cu dimensiunea primului ambreiaj. Coeficientul de corelație Pearson R = 0,45, ajustat R 2 = 0,162, P = 0,033

Numărul de spermatozoizi masculi este semnificativ corelat cu dimensiunea primului ambreiaj. Coeficientul de corelație Pearson R = 0,45, ajustat R 2 = 0,162, P = 0,033

Afișaj Sigmoid

Două femele nereceptive din acvariul de animale au fost utilizate alternativ pentru a stimula comportamentul sexual masculin în arena de testare. Nu s-a găsit nicio diferență semnificativă în răspunsul masculin la cele două femele și, prin urmare, datele pentru cele două femele au fost reunite în cadrul grupurilor de tratament.

Nivelul de afișare sigmoidă de către bărbați la aceste femele nereceptive a fost, de asemenea, afectat negativ, într-o manieră doză-răspuns, de vinclozolin (Fig. 4). Prin urmare, bărbații de control au efectuat în medie 0,96 afișaje pe minut față de femeie, în timp ce bărbații care au primit cea mai mare doză au efectuat doar 0,35 afișaje pe minut. Cu toate acestea, acest parametru a fost mai puțin sensibil la vinclozolin decât fecunditatea feminină sau numărul de spermatozoizi masculin și a fost doar semnificativ diferit de martorii la cea mai mare doză de vinclozolin. Numărul afișajelor sigmoide nu a fost corelat nici cu numărul de spermatozoizi (R = 0,275, P = 0,22), nici cu dimensiunea ambreiajului (R = -0,033, P = 0,885).

Tendința bărbaților de a efectua afișare sigmoidă către o femeie nereceptivă a fost, de asemenea, afectată de expunerea la vinclozolin, deși într-o măsură mai mică decât ceilalți doi parametri. Doar cea mai mare doză de expunere a cauzat o reducere semnificativă a numărului de afișaje efectuate pe minut. Studiile anterioare privind efectul vinclozolinului asupra guppiilor din laboratorul nostru au arătat că intensitatea comportamentului guppyului este mai ușor afectată dacă expunerea are loc de la naștere [7]. Astfel, expunerea tinerilor la o doză de numai 0,1 μg de vinclozolin/mg de alimente a fost suficientă pentru a elimina afișarea sigmoidă mai târziu la vârsta adultă. În schimb, atunci când a fost expus în timpul vieții adulte [6], s-a observat o reducere semnificativă la animalele care au primit 1 μg/mg, dar nu și 100 μg/mg.

În studiile în care sunt observați mai mulți bărbați în compania unei singure femele, femela va copula cu masculul care efectuează cel mai mult și cel mai lung afișaj sigmoid [36]. În studiul de față, a fost prezent doar un singur mascul, atât în ​​timpul fertilizării femelelor virgine, despre care se știe că sunt extrem de dornici de copulare [23], cât și în timpul măsurării afișării sigmoidei cu femelele nereceptive. Prin urmare, competiția dintre bărbați nu a fost un element în prezentul experiment. Din această perspectivă, nu este deloc surprinzător faptul că nu am găsit nicio corelație între intensitatea comportamentului sexual al unui individ și succesul său în fertilizarea unei femei virgine receptive. Mai mult, s-a demonstrat anterior că guppy-ul masculin își promovează fertilitatea prin colorarea și comportamentul său sexual astfel încât intensitatea comportamentului său sexual este corelată cu numărul de spermatozoizi per ejaculare [37]. În studiul de față, nu am putut găsi nicio dovadă a acestui tip de corelație, iar diferența se poate regăsi în lipsa concurenței masculine în protocolul experimental utilizat.