Diabet clinic

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Metformin: Dincolo de diabet Vezi toate cele 12 articole

Editat de
Graham Rena

Universitatea din Dundee, Regatul Unit

Revizuite de
Alison D. McNeilly

Universitatea din Dundee, Regatul Unit

Yuan Zhou

Universitatea din Beijing, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

asupra

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laboratorul cheie provincial Guangdong de conectom și comportament cerebral, Institutul de cunoaștere a creierului și de boli cerebrale (BCBDI), Institutele de tehnologie avansată din Shenzhen, Academia Chineză de Științe, Shenzhen, China
  • 2 Laboratorul cheie Shenzhen pentru boli respiratorii, Laboratorul cheie Shenzhen pentru microorganisme patogene și rezistență bacteriană, Departamentul de medicină pentru îngrijirea respiratorie și critică, Institutul Shenzhen pentru boli respiratorii, Spitalul popular Shenzhen, Primul spital afiliat al Universității de știință și tehnologie din sud, Al doilea colegiu medical clinic de la Universitatea Jinan, Shenzhen, China

Introducere

Creșterea epidemiei de obezitate necesită eforturi sporite pentru a identifica noi ținte terapeutice/strategii pentru tratamentul acestei tulburări metabolice. Factorii patogeni ai obezității s-au extins de la fondul genetic și factorii endocrini la controlul nervos central, incluzând comportamente anormale de hrănire și controlul neuronal direct al fiziologiei țesutului adipos (1, 2). S-au înregistrat progrese considerabile în ultimele decenii; cu toate acestea, sunt necesare mai multe cercetări pentru a rezolva întrebările din jurul acestei tulburări.

Metformina (dimetilbiguanidă) a devenit un agent de scădere a glicemiei pe cale orală de primă linie pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 2 (T2DM) (3, 4). La pacienții cu T2DM, care sunt, de asemenea, obezi, metformina joacă, de asemenea, un rol clinic în obezitate (5, 6). Mecanismul funcțional detaliat al acțiunii sale în obezitate are nevoie de investigații suplimentare. Metformina este derivată din galegină, un produs natural dintr-o plantă medievală europeană de plante medicinale Galega officinalis. Stabilit ca o terapie sigură și eficientă, metformina are mai multe moduri de acțiune și mecanismele sale moleculare nu sunt pe deplin descifrate, în ciuda utilizării sale clinice de peste 60 de ani (3, 4, 7). Una dintre țintele moleculare majore ale metforminei este senzorul de energie celulară Protein kinaza activată cu adenozin monofosfat (AMP) (AMPK) (7, 8). Pe lângă gluconeogeneza hepatică, s-au găsit ținte acumulatoare de țesuturi/organe pentru metformină, inclusiv țesutul adipos alb și maro (9), plămânul (10) și sistemul nervos central (11).

Deși se știe că are un fundal în factori genetici și de mediu, o cauză directă a obezității rămâne un dezechilibru între aportul caloric și cheltuială.În acest studiu, a fost utilizat un model de șoarece cu dietă bogată în grăsimi (HFD). Pentru caracteristicile sale cronice și complexitatea cheltuielilor de energie, ne-am concentrat pe faza incipientă a alimentării cu HFD în raport cu creșterea în greutate corporală. Astfel, tratamentul cu HFD a durat 3 săptămâni. Având în vedere implicațiile actuale ale alterării bacteriilor intestinale atât în ​​obezitate (12), cât și în diabetul tratat cu metformină (13), au fost, de asemenea, investigate modificările microbiotei intestinale în cadrul tratamentului HFD pe termen scurt și al metforminei. În plus, posibilele efecte nervoase centrale ale HFD au fost evaluate printr-un test comportamental în mișcare liberă în labirintul Elevated plus (EPM) și testul Open field (OFT). Având în vedere activarea raportată a căii AMPK de către metformină, imunomarcarea fosfo-AMPK a fost efectuată în WAT și creier.

Materiale și metode

Șoareci masculi C57BL/6J adulți (6 săptămâni) (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. China) au fost cazați în grup, având acces la pelete alimentare și apă ad libitum, și menținut pe un ciclu de lumină/întuneric de 12: 12 ore. Toate procedurile de creștere și experimentale din acest studiu au fost aprobate de Comitetele de îngrijire și utilizare a animalelor de la Institutul de Tehnologie Avansată din Shenzhen (SIAT), Academia Chineză de Științe (CAS), China.

Dieta bogată în grăsimi (HFD), dieta normală (ND) și tratamentul cu metformină

Trei grupuri de șoareci au fost supuse unor tratamente diferite: un grup a primit dieta normală (ND); un grup a primit dieta bogată în grăsimi (HFD); și un al treilea grup a primit dieta HFD și co-tratament cu metformin prin gavaj oral (300 mg/kg/zi, Sigma-Aldrich, BP227, St. Louis, MO). Soluția salină a fost administrată grupurilor ND și HFD prin gavaj oral. Pentru HFD, 60% din energie a fost derivată din grăsimi, în timp ce în ND, 10% din energie a fost derivată din grăsimi (Trophic Animal Feed High-Tech, China; TP23300 pentru HFD, TP23302 pentru ND). Formula pentru HFD a fost următoarea: cazeină (267 g/kg), maltodextrină (157 g/kg), zaharoză (89 g/kg), ulei de soia (33 g/kg), ulei de untură (301 g/kg), celuloză (67 g/kg), amestec mineral M1020 (66 g/kg), vitamină V1010 (13 g/kg), L-cistină (4 g/kg), bitartrat de colină (3 g/kg), TNHQ 0,067 g/kg).

Toate tratamentele au durat 3 săptămâni. Creșterea în greutate corporală a fost înregistrată zilnic pentru fiecare șoarece până în ziua 21. În dimineața zilei 21, s-au înregistrat greutăți corporale ale șoarecilor, s-au recoltat probe fecale și apoi șoarecii au fost supuși testului Elevated plus maze (EPM). În ziua 22, a fost efectuat testul în câmp deschis (OFT), apoi șoarecii au fost profund anesteziați și sacrificați. Țesuturile adipoase albe epididimale și creierul de la trei șoareci din fiecare grup au fost supuse unui studiu histologic suplimentar. Probele fecale ale șoarecilor au fost colectate în tuburi sterile, congelate rapid și apoi depozitate la -80 ° C până în ziua analizei.

Studiu histologic

În timp ce se aflau sub anestezie profundă, șoarecii au fost perfuzați transcardic cu 4% paraformaldehidă (PFA) în PBS, țesuturile adipose albe epididimale (WAT) și creierul au fost recoltate și fixate în 4% PFA. Probele de țesut WAT au fost încorporate în parafină și secțiuni de 4 μm au fost tăiate pe un microtom. Secțiunile au fost supuse colorării hematoxilinei și eozinei (H&E) pentru examinare morfologică și colorare imunofluorescentă pentru fosfo-AMPK (pAMPK). Pentru analiza mărimii adipocitelor, s-a măsurat diametrul mai lung al fiecărui adipocit. Pentru a evita analiza grupată, citirile de la un șoarece au fost mai întâi mediatizate și au utilizat media sa ca valoare unică pentru comparație ulterioară între diferite grupuri de tratament. Pentru a evalua extinderea adipocitelor, s-a calculat media tuturor adipocitelor numărate și adipocitele cu un diametru mai mare decât media tuturor celulelor măsurate în grupul ND a fost definită ca „adipocit mare”. Numărul și procentul adipocitelor mari au fost calculate ca parametru pentru mărirea adipocitelor.

De asemenea, creierele recoltate au fost post-fixate cu 4% PFA, crioprotejate în 30% zaharoză în PBS și tăiate pe un criostat în felii de 30 μm. Imunohistochimia a fost efectuată pentru a mapa expresia pAMPK în creier. Colorarea anticorpului a fost efectuată pe secțiuni de țesut plutitor cu un singur godeu. Secțiunile au fost incubate timp de 24 de ore în anticorpi primari la 4 ° C, urmată de incubare peste noapte cu anticorpi secundari la 4 ° C. Anticorpul principal utilizat a fost anti-pAMPK de iepure (# 2535, Cell Signaling Technology; 1:50). Anticorpii secundari adecvați au fost aleși pentru a dezvălui diferite culori fluorescente. Pentru contracolorare, secțiunile au fost incubate timp de 10 minute cu 40,6-diamidin-2-fenilindol (DAPI, 0,4 mg/ml, Sigma). Toate imaginile au fost capturate cu un microscop confocal Zesis LSM 880 sau cu un sistem de scanare a diapozitivelor de microscopie virtuală Olympus VS120.

Extracția ADN, secvențierea și analiza regiunii ARN-ului ribozomului 16S

Extracția ADN a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului - MOBIO PowerSoil ® ADN Kit de izolare 12888-100. ADN-ul a fost stocat la -80 ° C în soluție tampon Tris-EDTA. Pentru a permite amplificarea regiunii V4 a genei ARNr 16S și pentru a adăuga secvențe de coduri de bare, au fost proiectați primerii de fuziune unici pe baza setului de primer universal, 515F (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3 ') și 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'), împreună cu secvențe de coduri de bare. Amestecurile de PCR conțineau 1 μL din fiecare primer și invers (10 μM), 1 μL de ADN șablon, 4 μL de dNTPs (2,5 mM), 5 μL de 10 × EasyPfu Buffer, 1 μL de Easy Pfu DNA Polymerase (2,5 U/μL) și 1 μL de apă dublă distilată într-un volum total de reacție de 50 μL. Ciclarea termică a constat într-o etapă inițială de denaturare la 95 ° C timp de 5 min, urmată de 30 de cicluri de denaturare la 94 ° C timp de 30 s, recoacere la 60 ° C timp de 30 s și extindere la 72 ° C timp de 40 s, cu o etapă finală de extensie la 72 ° C timp de 4 minute. Dimensiunea așteptată a benzii pentru 515f-806r este

300–350 bp verificat cu gel de agaroză. Cuantificați ampliconii cu kitul de analiză Quant-iT PicoGreen dsDNA (ThermoFisher/cat. Invitrogen nr. P11496). Biblioteca amplicon pentru secvențierea de mare viteză pe platforma Illumina MiSeq de către Promegene, China a fost combinată o cantitate egală și ulterior cuantificată (KAPA Library Quantification Kit KK4824) conform instrucțiunilor producătorului. Folosind pipeline-ul 1.8.0 Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME), secvențele brute au fost procesate pentru concatenarea citirilor în etichete în funcție de relația de suprapunere, apoi, citirile aparținând fiecărei probe au fost separate cu coduri de bare și citirile de calitate scăzută au fost eliminate . Etichetele procesate au fost grupate în unitățile taxonomice operaționale (OTU) la pragul similar de 97% utilizat în mod obișnuit. OTU-urile au fost alocate taxei prin potrivirea cu baza de date Greengenes (versiunea 13.8). A fost construit un arbore filogenetic cu secvențe reprezentative. Au fost efectuate analize ale diversității alfa și beta. Distanțele au fost calculate cu R (3.3.1, pachetul flexmix).

Elevated Plus Maze (EPM) și analiză comportamentală

Șoarecii au fost așezați pe un labirint cu patru brațe plus două brațe deschise și două brațe închise (PVC alb, 30 cm lungime per braț × 5 cm lățime), care a fost ridicat la 50 cm deasupra solului pentru o sesiune de 15 minute. EPM a fost curățat între șoareci cu soluție de etanol 20%. Numărul de intrări în brațele deschise, timpul petrecut în brațele deschise și distanța parcursă în brațele deschise au fost înregistrate și analizate de software-ul Anymaze ® (Stoelting Co., IL, SUA).

Test de câmp deschis (OFT) și analiză comportamentală

O arenă de câmp deschis (50 cm × 50 cm × 50 cm) din PVC alb a fost utilizată pentru a evalua atât activitatea locomotorie, cât și comportamentul de anxietate al animalelor. Intrările în centru, timpul în centru, distanța parcursă în centru, distanța totală parcursă în OF, viteza medie în OF pentru o sesiune de 5 minute au fost înregistrate și apoi analizate de software-ul Anymaze ® (Stoelting ). Câmpul deschis a fost curățat între șoareci cu soluție de etanol 20%.

Analize statistice

Datele au fost exprimate ca medie ± SEM (Figurile 1-3) și Box și Mustăți (Figura 5). Semnificația statistică a fost stabilită la p * p ** p **** p * p ** p 0,05, lui Cohen d = 0,43; HFD vs. HFD + Met, p 0,05, lui Cohen d = 0,83; pentru Time in Center, ND vs. HFD, p 0,05, lui Cohen d = 1,36; pentru Distanță în centru, ND vs. HFD, p 0,05, lui Cohen d = 1,11). În EPM, HFD și-a arătat efectul în inducerea anxietății, cum ar fi comportamentul și salvat prin co-tratament cu metformină. Distanța parcursă în brațul deschis a scăzut în HFD comparativ cu ND, care a fost atenuată prin co-tratament cu metformină (Figura 3C, n = 5 pentru fiecare grup, fiecare punct reprezintă un animal; ND vs. HFD, p 0,05, lui Cohen ds = 0,52 și 0,86; pentru viteza medie, ps > 0,05, Cohen's ds = 0,53 și 0,87). Deși nu a existat nicio corelație între modificările greutății corporale în ziua 21 și parametrii testelor OFT și EPM (toate R au pătrat 0,05), în timp ce parametrii testelor OFT și EPM au fost puternic corelați (pentru Distanța în brațe deschise a EPM vs. Distanță în centrul OFT, R pătrat = 0,43, p 0,8). Analiza diversității beta a arătat diferențe semnificative între grupuri după diferențierea Bray-curtis (Figura 5C), UniFrac neponderată (Figura 5D) și analiza UniFrac ponderată (Figura 5E), p Cuvinte cheie: dietă bogată în grăsimi, metformină, anxietate, microbiota intestinală, obezitate

Citare: Ji S, Wang L și Li L (2019) Efectul metforminei asupra creșterii în greutate pe termen scurt, indusă de dietă bogată în grăsimi și comportament asemănător anxietății și microbiotei intestinale. Față. Endocrinol. 10: 704. doi: 10.3389/fendo.2019.00704

Primit: 10 ianuarie 2019; Acceptat: 30 septembrie 2019;
Publicat: 18 octombrie 2019.

Graham Rena, Universitatea din Dundee, Regatul Unit

Yuan Zhou, Universitatea din Beijing, China
Alison Delamere McNeilly, Universitatea din Dundee, Regatul Unit