Efectul HspB6 asupra cineticii de agregare a UV-Ph b (0,25 mg/mL) în absență (A, C) și în prezența Arg 0,1 M (B, D) la 37 ° C. (A, B) Dependențele intensității de împrăștiere a luminii (I - I 0) de timp. Concentrațiile de HspB6 sunt prezentate în panouri (A, B). (C, D) Dependențele razei hidrodinamice R h, 2 a agregatelor de proteine ​​în timp obținute la următoarele concentrații de HspB6: (1) 0, (2) 0,025, (3) 0,1, (4) 0,3 și (5) )) 1 mg/ml.

ijms

Efectul HspB6 asupra parametrilor cinetici ai agregării UV-Ph b (0,25 mg/ml) în absență și în prezența Arg 0,1 M la 37 ° C. (A) Dependențele ratei inițiale relative a agregării UV-Ph b pentru etapa de creștere a agregatului, v 0/v 0 (0) și (B) valoarea relativă a duratei etapei de nucleație, t */t * 0, pe raportul concentrațiilor molare de HspB6 și UV-Ph b. Punctele sunt date experimentale. Liniile solide din panoul A sunt calculate din ecuația (2). Curbele 1 și 2 în panouri (A, B) sunt obținute în absență și, respectiv, în prezența Arg 0,1 M.

Efectul a 14-3-3ζm asupra cineticii de agregare a UV-Ph b (0,25 mg/ml) în absență (A, C) și în prezența Arg 0,1 M (B, D) la 37 ° C. (A, B) Dependențele intensității de împrăștiere a luminii (I - I 0) de timp. Concentrațiile de 14-3-3ζm sunt prezentate în panouri (A, B). (C, D) Dependențele razei hidrodinamice R h, 2 a agregatelor de proteine ​​în timp obținute la următoarele concentrații de 14-3-3ζm: în panoul (C) (1) 0, (2) 0,05, (3) 0,3, (4) 0,7 și (5) 0,9 mg/ml; în panou (D) (1) 0, (2) 0,05, (3) 0,3, (4) 0,4 și (5) 0,7 mg/ml.

Efectul a 14-3-3ζm asupra parametrilor cinetici ai agregării UV-Ph b (0,25 mg/ml) în absență și în prezența Arg 0,1 M la 37 ° C. (A) Dependențele ratei inițiale relative a agregării UV-Ph b în stadiul creșterii agregate, v 0/v 0 (0) și (B) valoarea relativă a duratei etapei de nucleație, t */t * 0, pe raportul concentrațiilor molare de 14-3-3ζm și UV-Ph b. Punctele sunt date experimentale. Liniile solide din panoul (A) sunt calculate din ecuația (2). Curbele 1 și 2 în panouri (A, B) sunt obținute în absență și, respectiv, în prezența 0,1 M Arg.

Efectul Arg asupra fluorescenței triptofanului HspB6. (A) Spectrele de fluorescență ale triptofanului HspB6 (0,32 mg/ml) în tampon hepatic 0,03 M, conținând 0,5 mM ditiotreitol (DTT) și în prezența concentrațiilor crescânde de Arg de la 0 la 0,09 M. Spectrele au fost obținute la 25 ° C, lungime de undă de excitație de 292 nm și forță ionică constantă de 0,15 M. (B) Dependența intensității fluorescenței de concentrația Arg la λ = 338,8 nm. Punctele sunt datele experimentale. Curba solidă a fost calculată folosind ecuația (4) la K diss = 0,01 M, F 0 = 95,6 și F lim = 139. Linia de linie orizontală corespunde valorii F lim. (C) Dependența emisiilor maxime de Trp (λmax) de concentrația Arg.

Efectul Arg asupra fluorescenței triptofanului de 14-3-3ζm. (A) Spectrele de fluorescență ale triptofanului de 14-3-3ζm (0,48 mg/ml) în tampon Hepes 0,03 M, conținând DTT 0,5 mM și în prezența concentrațiilor crescânde de Arg de la 0 la 0,09 M. Spectrele au fost obținute la 25 ° C, lungime de undă de excitație de 292 nm și forță ionică constantă de 0,15 M. (B) Dependența intensității fluorescenței de concentrația Arg la λ = 336,5 nm. Punctele sunt datele experimentale. Curba solidă a fost calculată folosind ecuația (4) la K diss = 0,049 M, F 0 = 159 și F lim = 524. Linia de linie orizontală corespunde valorii F lim. (C) Dependența emisiilor maxime de Trp (λmax) de concentrația Arg.

Efectul Arg asupra stabilității termice a chaperonelor proteice. Dependențele de temperatură ale capacității de căldură în exces (Cp) obținută de DSC (A) pentru HspB6 (1,2 mg/mL) și (B) pentru 14-3-3ζm (1 mg/mL) în absență și în prezența 0,1 M Arg (curbele 1 și respectiv 2). Puterea ionică în ambele cazuri a fost de 0,15 M. Rata de încălzire a fost de 1 ° C/min.

Schema care ilustrează calea de agregare de bază pentru agregarea UV-Ph b la 37 ° C [40].

Abstract

1. Introducere

2. Rezultate

2.1. Efectul Arg asupra activității asemănătoare Chaperone a HspB6 și 14-3-3 monomerice

2.2. Efectul Arg asupra spectrelor fluorescenței triptofanului de șaperoni

2.3. Efectul Arg asupra stabilității termice a chaperonelor

3. Discuție

Sunt necesare 12 subunități de HspB6. În același timp, este nevoie de aproape 2,6 ori mai multe subunități de 14-3-3ζm (

30 de subunități) pentru a obține efectul protector similar. Trebuie subliniat faptul că s-au obținut date similare în prezența Arg 0,1 M: prevenirea completă a agregării UV-Ph b a cerut de aproape trei ori mai multe subunități de 14-3-3ζm decât HspB6 (

8 și 24 de subunități ale HspB6 și respectiv 14-3-3ζm). Cu toate acestea, cel mai important rezultat este o scădere semnificativă a valorii S 0 în prezența Arg observată pentru ambele proteine ​​studiate. Pentru HspB6, valoarea S 0 în prezența Arg 0,1 M a scăzut de 1,4 ori și pentru 14-3-3ζm a avut loc o scădere de 1,2 ori a valorii S 0. Aceste date sugerează că activitatea anti-agregare a acestor chaperoni crește în prezența Arg 0,1 M. Efectul Arg asupra valorii S 0 (Figura 2A și Figura 4A) este asociat cu modificări induse de Arg în starea conformațională a proteinei chaperone și UV-Ph b, aceste modificări rezultând în alterarea afinității chaperonei pentru proteina țintă . Datele prezentate indică faptul că pentru sistemul de testare, bazat pe agregarea termică a UV-Ph b la 37 ° C, proteina mică de șoc termic HspB6 are o activitate anti-agregare mai mare decât forma monomerică de 14-3-3ζ.