Abstract

Scop: Se știe că chisturile endometriotice se transformă în cancere ovariene, cum ar fi carcinoamele cu celule clare și cele endometrioide. Am emis ipoteza că un mediu bogat în fier produs de repetarea hemoragiei în chisturile endometriotice în timpul perioadei de reproducere poate juca un rol crucial în carcinogeneza chisturilor prin stresul oxidativ persistent indus de fier.

chisturi

Proiectare experimentală: Conținutul chisturilor ovariene umane, incluzând 21 de chisturi endometriotice, 4 carcinoame cu celule clare și 11 chisturi nonendometriotice, au fost analizate pentru concentrații de fier „catalitic” liber, lactoză dehidrogenază, potențial antioxidant, peroxid lipidic și 8-hidroxi-2′- deoxiguanozină (8-OHdG). Depunerea de fier și nivelurile de 8-OHdG au fost, de asemenea, analizate histologic. Speciile reactive de oxigen și mutagenitatea conținutului din chistul endometriotic au fost determinate in vitro.

Rezultate: Concentrația fierului liber în chisturile endometriotice (100,9 mmol/L) a fost semnificativ mai mare decât în ​​chisturile nonendometriotice (0,075 mmol/L; P 10 ani) ale endometriozei ovariene (6). Endometrioza patologic atipică, care se caracterizează prin glande endometriotice cu atipie citologică și/sau arhitecturală (7), a fost raportată la 22,6% (7 din 31) endometrioide și 36,0% (18 din 50) adenocarcinoame cu celule clare ale ovarului, întrucât în ​​doar 1,7% (4 din 255) din cazurile de endometrioză ovariană ordinală (8). Cancerul ovarian apărut în chistul endometriotic arată incidența predominantă a tipurilor de celule clare și endometrioide (> 40%), în timp ce adenocarcinomul seros și mucinos este predominant în cancerele ovariene care nu au legătură cu endometrioza (8), sugerând diferitele mecanisme de carcinogeneză între cancerul din chistul endometriotic ovarian și cancerul ovarian în general.

Caracteristicile bimoleculare ale cancerelor ovariene apărute în chistul endometriotic au fost, de asemenea, studiate pe larg, cum ar fi mutația genelor K-RAS și PTEN (9), modificarea BCL-2 și P53 (10), scăderea expresiei hMLH și PTEN (11) ).), și factor crescut de creștere endotelială vasculară (12). Se raportează, de asemenea, pierderea heterozigozității în regiunea oncosupresoare în endometrioză (7, 13) și pierderea obișnuită a heterozigoității în endometrioza și carcinomul concomitent (14). S-a raportat că modelul genetic al șoarecilor de endometrioză peritoneală se dezvoltă prin inducerea K-ras oncogenă și a adenocarcinomului ovarian endometrioid prin ștergerea ulterioară a Pten (15). Prin urmare, au fost identificate mai multe mecanisme moleculare implicate în carcinogeneza endometriozei. Cu toate acestea, mecanismul precis care poate explica unicitatea carcinogenezei în chistul endometriotic rămâne încă de elucidat.

Hemoragia repetată în chist în timpul ciclului menstrual și acumularea de componente sanguine în chist sunt caracterizate în chistul endometriotic. În acest studiu, ne-am concentrat asupra conținutului chisturilor endometriotice, în special a concentrației ridicate de fier liber, ca cauză a carcinogenezei chistului. Sub ipoteza că fluidul chisturilor endometriotice care conțin fier contribuie la modificări genetice prin stres oxidativ (16-18) și poate fi una dintre cauzele majore ale transformării maligne a chisturilor endometriotice, am examinat concentrația de fier din chistul endometriotic și alte chisturi. De asemenea, am examinat produsele stresului oxidativ din conținutul chisturilor. S-au făcut experimente in vitro dacă conținutul chisturilor endometriotice poate induce sau nu leziuni ale ADN-ului.

Materiale și metode

Mostre. Probele au fost obținute de la pacienți cu chisturi ovariene tratate chirurgical la Spitalul Universitar din Kyoto cu forme scrise de consimțământ. Conținutul chisturilor ovariene a fost depozitat la -80 ° C imediat după operație sau centrifugat la 3.000 sau 4.000 rpm timp de 10 minute; supernatanții au fost apoi depozitați la -80 ° C.

Cultură de celule. Celulele epiteliale ale suprafeței ovariene imortalizate stabilite de noi au fost menținute așa cum s-a descris anterior (19, 20). Celule glandulare endometriale imortalizate umane, oferite cu amabilitate de Dr. S. Kyo (Universitatea Kanazawa, Kanazawa, Japonia; ref. 21) și linia celulară de fibroblast pulmonar de hamster chinezesc (celule V79) achiziționate de la RIKEN BioResource Center Bank Cell, au fost cultivate în DMEM (Nikken Bio Medical Laboratory) conținând penicilină-streptomicină 100 unități/ml penicilină, 100 μg/ml streptomicină; Nacalai Tesque) și 10% ser fetal bovin (v/v; BioWest).

Detectarea fierului liber (ioni de fier) ​​în lichidul chistic. Amestecul de reacție a fost adăugat în tuburi de unică folosință din plastic, fără ioni, în următoarea ordine: 0,5 ml de timus de vițel ADN sare de sodiu tip I (1 mg/ml; Sigma-Aldrich), 0,05 ml de clorhidrat de bleomicină (1 mg/ml; furnizate de Nippon Kayaku), 0,1 mL MgCl2 (50 mmol/L; Nacalai Tesque), 0,1 mL de probă, 0,05 mL HCl (10 mmol/L; Nacalai Tesque), 0,1 mL de apă ultrapură și 0,1 mL de 0,14% ascorbic soluție acidă (g/v; Nacalai Tesque). S-a preparat o curbă standard folosind Fe (NO3) 3 dizolvat în apă ultrapură. Probele de lichide chistice endometriotice au fost dizolvate în apă ultrapură de la 1 la 40.000 de ori pentru a obține concentrații de fier libere între 0 și 250 μmol/L. Conținutul tubului a fost amestecat înainte și după adăugarea de ascorbat și apoi incubat la 37 ° C timp de 2 ore cu agitare. Apoi, s-a adăugat 1 ml EDTA 0,1 mol/L (Dojindo) pentru a opri reacția, iar conținutul tubului a fost amestecat cu 1 ml acid tiobarbituric 1% (g/v; Merck) în NaOH 50 mmol/L (Nacalai Tesque ).) și 1 ml de HCI 25% (v/v; Nacalai Tesque). Soluțiile au fost încălzite la 100 ° C timp de 15 min și răcite, iar cromogenul a fost măsurat prin absorbanță la 532 nm.

Detectarea lactozei dehidrogenazei în lichidul chistic. Probele stocate pentru analize chimice au fost decongelate și centrifugate la 3.000 rpm timp de 10 minute și analizate prin metoda recomandată de Societatea Japoneză de Chimie Clinică folosind CicaLiquid lactoză dehidrogenază J (Kanto Chemical Co., Inc.). Dacă rezultatul a fost> 1.000 UI/L, proba a fost diluată de 10 ori în soluție de NaCI 0,9%.

Detectarea potențialului antioxidant în lichidul chistic. Potențialul antioxidant (PAO) a fost măsurat utilizând un kit de testare PAO (Institutul Japonez pentru Controlul Îmbătrânirii, Nikken SEIL Corp.), care măsoară capacitatea antioxidantă utilizând reducerea ionului cupric (Cu 2+ la Cu +), conform producătorului protocol. Probele stocate au fost decongelate și centrifugate la 10.000 × g la 4 ° C timp de 60 de minute. Supernatanții ultrafiltrați cu o greutate moleculară de 10.000 au fost analizați folosind kitul.

Detectarea peroxidului lipidic în lichidul chistic. Probele stocate pentru analize chimice au fost decongelate și centrifugate la 3.000 rpm timp de 10 min, iar nivelurile de peroxid lipidic (LPO) au fost determinate prin metoda hemoglobinei-albastru de metilen utilizând Determinatorul LPO (Kyowa Medix Co. Ltd.).

Detectarea 8-hidroxi-2-deoxiguanozinei în lichidul chistic. 8-hidroxi-2'-deoxiguanozina (8-OhdG) este unul dintre principalii produse de bază ADN modificate oxidativ in vivo și este predispus la mutație (G: C la T: A transversie; ref. 22). Probele stocate au fost decongelate și centrifugate la 10.000 × g la 4 ° C timp de 60 min. Supernatantele ultrafiltrate cu o greutate moleculară limită de 10.000 au fost analizate folosind un kit ELISA de verificare 8-OHdG High-Sensitive (Institutul Japonez pentru Controlul Îmbătrânirii, Nikken SEIL Corp.).

Colorare albastră prusiană a probelor de țesut uman pentru detectarea fierului. Țesuturile au fost fixate în 10% formalină tamponată și încorporate în parafină. Secțiunile au fost deparafinizate și imersate timp de 20 de minute într-o soluție de lucru constând din cantități egale de ferocianură de potasiu 5% [K4Fe (CN) 6] și soluție de acid clorhidric 5% (Nacalai Tesque). Contracolorarea a fost făcută cu Nuclear Fast Red (Lab Vision Corp.) timp de 5 minute.

Evaluarea depozitelor de fier în probele de țesut uman. Depunerea de fier a fost clasificată după colorarea albastră a Prusiei în conformitate cu metoda lui Blanc și colab. (23), cu unele modificări, după cum urmează: gradul 0, absența fierului; gradul 1, depunere ușoară cu fier abia confirmat la mărire × 400; gradul 2, depunere moderată cu fier vizibil la mărire × 40; și gradul 3, depunere severă cu fier vizibil pe diapozitive de sticlă cu ochiul liber.

Analiza imunohistochimică a 8-OHdG în probe de țesut uman. Țesuturile fixate în formalină tamponată 10% și încorporate în parafină au fost deparafinizate și hidratate, iar colorarea imunohistochimică a 8-OHdG s-a făcut așa cum s-a descris anterior (24) folosind anticorpul monoclonal anti-8-OHdG (N45.1) ca anticorp primar, biotina - anticorp IgG anti-șoarece de iepure marcat ca anticorp secundar și streptavidină conjugată cu peroxidază (Vector Laboratories).

Evaluarea 8-OHdG în probe de țesut uman. Formarea 8-OHdG a fost evaluată printr-o metodă imunohistochimică și definită după cum urmează: ++, evident mai puternică decât stroma ovariană normală; +, ușor sau parțial (6 pe godeu. După 24 de ore de incubare, mediul a fost schimbat cu mediu care conține materialele testate și culturile au fost incubate în continuare timp de 24 de ore. Apoi, celulele au fost clătite cu PBS și recoltate, placate pe 100 - vase de cultură mm la 1 × 10 6 per vas și cultivate timp de 6 zile, recoltate, replate în 6-TG - mediu care conține (10 μg/mL; Sigma-Aldrich) la 3 × 106 pentru fiecare vas de 100 mm și cultivate încă 12 zile. Fiecare tratament a fost făcut în triplicat folosind trei probe în fiecare experiment. Coloniile au fost colorate cu soluția Giemsa (Nacalai Tesque) și s-a numărat numărul de colonii din fiecare fel de mâncare. Metansulfonat de etil (Nacalai Tesque; 500 μg/ml) a fost utilizat ca control pozitiv și mediu normal a fost utilizat ca control negativ.

A, concentrația fierului liber în chisturi endometriotice (n = 21; medie ± SD: 100,9 ± 115,1 mmol/L), carcinom cu celule limpezi (n = 4; medie ± SD: 4,27 ± 2,42 mmol/L) și chisturi nonendometriotice n = 11; medie ± SD: 0,075 ± 0,081 mmol/L). B, concentrația de lactoză dehidrogenază ca marker de deteriorare a țesuturilor în chisturi endometriotice (n = 20; 7.715 ± 4.540 UI/L), carcinom cu celule clare (n = 4; 5.817 ± 4.739 UI/L) și chisturi nonendometriotice (n = 11 64,5 ± 102,5 UI/L). C, concentrația PAO ca marker antioxidant în chisturi endometriotice (n = 18; 1.164 ± 687 mmol/L), carcinom cu celule clare (n = 4; 1.062 ± 119 mmol/L) și chisturi nonendometriotice (n = 11; 557 ± 264 mmol/L). D, concentrația de LPO ca marker oxidativ în chisturile endometriotice (n = 18; 75,7 ± 73,4 nmol/mL), carcinomul cu celule clare (n = 3; 25,2 ± 17,7 nmol/mL) și chisturile nonendometriotice (n = 10; 2,93 ± 5,48 nmol/ml). E, concentrația de 8-OHdG ca oxidant și marker de deteriorare a ADN-ului în chisturile endometriotice (n = 19; 0,588 ± 0,612 ng/mL), carcinomul cu celule clare (n = 4; 0,181 ± 0,237 ng/mL) și chisturile nonendometriotice ( n = 11; 0,0266 ± 0,0592 ng/ml). F, s-a găsit o corelație pozitivă semnificativă între fierul liber și 8-OHdG (P = 0,0000000046). Δ, medie; •, fiecare rezultat.

Detectarea factorilor legați de stresul oxidativ din conținutul chisturilor. Nivelul lactozei dehidrogenazei, un marker de deteriorare a țesuturilor, a fost semnificativ mai mare la chisturile endometriotice (7.715 ± 4.540 UI/L) decât la celelalte chisturi benigne ovariene (64,5 ± 102,5 UI/L; P = 0,000040). Concentrația medie de PAO, un marker antioxidant, a fost semnificativ mai mare la chisturile endometriotice (1,164 ± 687 mmol/L) decât la cistadenomul seros sau mucinos (557 ± 264 mmol/L; P = 0,0032). Concentrațiile de LPO, un marker oxidativ și 8-OHdG, un marker oxidativ al deteriorării ADN-ului, au fost semnificativ mai mari în chisturile endometriotice (75,7 ± 73,4 nmol/ml și 0,588 ± 0,612 ng/ml, respectiv) decât cele din alte chisturi. ± 5,48 nmol/mL, P = 0,00014 și 0,0266 ± 0,0592 ng/mL, P = 0,000048, respectiv; Fig. 1B-E). Carcinomul cu celule clare a prezentat niveluri intermediare între chisturile endometriotice și alte chisturi benigne în ceea ce privește toate substanțele. Concentrația de 8-OHdG a fost semnificativ corelată cu cea a fierului liber (P = 0,0000000046; Fig. 1F).

Depozite de fier în chisturile ovariene și țesuturile cancerului ovarian. Depunerea de fier în celulele epiteliale endometriotice a fost observată histologic prin colorarea albastră a Prusiei (Tabelul 1). În chisturile endometriotice, gradul 3 a fost marcat în 14 cazuri (70%), în timp ce în alte chisturi ovariene benigne, gradul 0 a fost marcat în toate cazurile, cu excepția unuia (92,9%). În chisturile endometriotice, depunerile de fier au fost detectate în stromă și uneori în celulele glandulare epiteliale (Fig. 2A și B). A existat o diferență semnificativă statistic în depunerea de fier între chisturile endometriotice și chisturile nonendometriotice (P = 0,00013). În cancerul ovarian fără chisturi endometriotice, gradul 0 a fost notat în opt cazuri (66,7%). În cancerul ovarian cu chisturi endometriotice, gradul 0 a fost notat în trei cazuri (15%), gradul 1 în șase cazuri (30%), gradul 2 în nouă cazuri (45%) și gradul 3 în două cazuri (10%). Câteva tipuri de cancer cu celule limpezi cu endometrioză au prezentat depozite de fier, în special în zona de transformare dintre endometrioză și celule canceroase ovariene (Fig. 2C), în timp ce doar un caz malign fără endometrioză conținea depunere de fier de gradul 3. Endometrioza atipică a fost observată în zona de transformare a cinci cazuri de cancer cu celule clare. Patru cazuri au prezentat depunere de fier de gradul 2 în zona stromală, dar nu în epiteliu (Fig. 2D).

Colorarea albastră prusiană a depozitelor de fier în tumorile ovariene