A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Chandirasegaran Massilamany, Arunakumar Gangaplara

mutații

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Chandirasegaran Massilamany, Arunakumar Gangaplara

Adresa actuală: Laboratorul de Imunologie, Institutele Naționale de Alergie și Boli Infecțioase, Institutele Naționale de Sănătate, Bethesda, Maryland, Statele Unite ale Americii

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Centrul de afiliere pentru biotehnologie, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Afiliații Școala de Medicină Veterinară și Științe Biomedice, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii, Centrul de Virologie din Nebraska, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

Școala de afiliere de medicină veterinară și științe biomedicale, Universitatea din Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska, Statele Unite ale Americii

  • Chandirasegaran Massilamany,
  • Arunakumar Gangaplara,
  • Rakesh H. Basavalingappa,
  • Rajkumar A. Rajasekaran,
  • Hiep Vu,
  • Jean-Jack Riethoven,
  • David Steffen,
  • Asit K. Pattnaik,
  • Jay Reddy

Corecţie

31 august 2015: Massilamany C, Gangaplara A, Basavalingappa RH, Rajasekaran RA, Vu H, și colab. (2015) Corecție: Mutații în 5 'NTR și proteina nestructurală 3A a Coxsackievirus B3 atenuează selectiv miocarditogenitatea. PLOS ONE 10 (8): e0137433. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137433 Vizualizați corectarea

Cifre

Abstract

Citare: Massilamany C, Gangaplara A, Basavalingappa RH, Rajasekaran RA, Vu H, Riethoven J-J, și colab. (2015) Mutații în NTR 5 ’și proteina nestructurală 3A a Coxsackievirus B3 selectiv atenuează miocarditogenitatea. PLOS ONE 10 (6): e0131052. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0131052

Editor: Juan C. de la Torre, Institutul de Cercetare Scripps, STATELE UNITE

Primit: 13 mai 2015; Admis: 26 mai 2015; Publicat: 22 iunie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de grantul Nebraska Research Initiative. CM este beneficiarul unei burse de cercetare postdoctorală acordată de Fundația Miocardită, NJ.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Materiale și metode

Declarație de etică

Șoarecii A/J, C57BL/6 și BALB/c în vârstă de șase până la opt săptămâni au fost procurați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME). Șoarecii au fost întreținuți în conformitate cu ghidurile de protocol pentru animale ale Universității din Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE; Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Universității a aprobat protocolul experimental (numărul permisului: A3459-01; numărul protocolului: 973).

Propagarea virusului, titrarea și inducerea bolii

Histopatologie

Inimile și pancreasele au fost fixate prin imersie în 10% formalină tamponată cu fosfat și prelucrate pentru examinare histologică [28]. Pe scurt, trei secțiuni ale inimii cu diametrul întreg au fost tăiate la 5 μm grosime și colorate cu hematoxilină și eozină (H și E). Secțiunile au fost examinate de consiliul de administrație (Colegiul American de Patologi Veterinari) - patolog certificat, Dr. David Steffen a orbit de tratament. Scorurile de patologie au fost generate prin enumerarea focarelor de inflamație, necroză, mineralizare și fibroză. Scorurile individuale au fost utilizate pentru a compara natura calitativă a leziunilor. Scorurile totale reprezintă focarele totale ale schimbării patologice în cele trei secțiuni ale inimii. Modificările multiple prezente într-un singur focar au fost numărate ca 1 în numărul total [23,29]. Severitatea modificării pancreatice a fost estimată ca procent de implicare a secțiunii tisulare dintr-o secțiune aleatorie a pancreasului. Natura leziunilor pancreatice a fost observată ca atrofie, inflamație, mineralizare și necroză sau o combinație a acestora [23,29].

Derivarea clonei cDNA infecțioase de lungime completă a CVB3 și transcrierea in vitro

Folosind ADNc sintetizat din ARN-ul virusului Wt CVB3 (Nancy), fragmentele suprapuse 1 și 2 au fost amplificate prin PCR pentru a genera o clonă ADNc de lungime completă. În timp ce secvențele promotorului RsrII și T7 ARN polimerază au fost inserate în amonte de NTR 5 'a fragmentului 1, secvențele poli (A) (59 reziduuri de adenozină) și PacI au fost inserate în aval la NTR 3' a fragmentului 2. Fragmentele au fost clonate în vectorul pBR322 și secvențiat. Harta vectorială a fost derivată utilizând software-ul SimVector.

Amplificarea rapidă a capetelor ADNc (RACE)

Recuperarea virusului infecțios din ARN viral transcris in vitro

Celulele Vero crescute până la 80% confluență au fost tripsinizate și spălate de două ori cu 1x PBS prin centrifugare la 400xg timp de 6 minute la temperatura camerei (RT). Celulele au fost resuspendate în tampon de electroporare (Biorad, Hercules, CA) la o densitate celulară de 10x106 celule/ml. ARN-ul viral transcris in vitro (5 μg) a fost luat într-o cuvă de electroporare de 0,4 cm (Biorad) și apoi s-a adăugat suspensie celulară (2x106 celule în 200 μl). Amestecul a fost supus electroporării utilizând sistemul de electroporație Gene Pulser Xcell la 160V (Biorad), conform recomandărilor producătorului. Celulele electroporate au fost aspirate ușor și transferate pe plăci cu 6 godeuri conținând 2 ml de EMEM proaspăt/10% FBS preîncălzit la 37 ° C. După 16 ore, mediul a fost îndepărtat; celulele au fost spălate cu 1x PBS și înlocuite cu 2 ml de EMEM proaspăt/2% FBS. Celulele au fost incubate până la 4 zile și, pe măsură ce CPE a devenit evident, supernatanții care conțin virus au fost recoltați, trecuți și titrați și depozitați ca mai sus.

Crearea de noi virusuri derivate din clone infecțioase pentru a reveni la mutațiile observate în virusul pBRCVB3

După secvențierea și constatarea prezenței a trei noi modificări nt - C97U în 5 'NTR și A4327G și C5088U în proteinele NS 2C și respectiv 3A, respectiv în virusul pBRCVB3 (Tabelul 2) - am căutat să inversăm aceste mutații prin generarea a trei noi clone infecțioase de ADNc folosind pBRCVB3 ca coloană vertebrală (S1 Fig.). Acestea includ: 1) U97C fix (pBRCVB3/97); 2) G4327A și U5088C fix (pBRCVB3/4327_5088); și 3) U97C, G4327A și U5088C fixe (pBRCVB3/97_4327_5088). Derivarea acestor clone a necesitat sinteza segmentelor genetice pentru a fi încorporate în pBRCVB3 (Genscript, Piscataway, NJ). Pentru a genera pBRCVB3/97, un fragment de 290 bp conținând nt C în poziția dorită (97) a fost donat în situri RsrII (5 ’) și BstBI (3’) în pBRCVB3. La fel, un fragment (2036 pb) care poartă modificarea nt dorită (A/4327 și C/5088) a fost donat în pBRCVB3 la siturile BssHII (5 ’) și BstEII (3’) pentru a obține pBRCVB3/4327_5088. În cele din urmă, pBRCVB3/97_4327_5088 a fost obținut prin donarea fragmentului (2036 pb) eliberat din pBRCVB3/4327_5088 în pBRCVB3/97 după digestia cu BssHII și BstEII. Procedurile de transcriere in vitro și recuperarea virușilor infecțioși au fost descrise mai sus.

Imunofluorescența

analize statistice

Titrurile virale au fost determinate în zilele 4 și 6 postinfecție pentru Wt CVB3 și variantele sale. Datele au fost testate nesemnificative pentru normalitate prin testul Lilliefors [31]. Pe baza unei distribuții non-normale, s-a aplicat testul Kruskal-Wallis [32], cu contrastele ulterioare între variantele cu corecție de testare multiplă prin intermediul criteriului de diferență sincer semnificativ al lui Tukey [33]. A fost creat un model mixt liniar generalizat pentru a determina diferențele dintre greutățile corporale între grupuri. Au fost utilizate mai multe structuri de covarianță pentru a calcula calitatea relativă a modelului, determinată de criteriul informației Akaike [34] corectat pentru dimensiunile probelor finite (605,53 ≤ AICc ≤ 673,18). Ante-dependența a avut cea mai bună potrivire (AICc = 605,53) și a fost selectată. Curbele de supraviețuire au fost analizate prin regresia riscurilor proporționale Cox [35]. Diferențele în medianele leziunilor miocardice au fost analizate prin testul non-parametric Wilcoxon rank sum [36]. Analiza MANOVA unidirecțională a fost efectuată pentru a evalua diferențele în pancreatită. Toate testele statistice au fost efectuate în MATLAB (R2014b, The Mathworks Inc., Natick, MA, SUA), cu excepția testului asupra greutăților corporale, care a fost efectuat folosind procedura GLIMMIX în SAS (versiunea 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, STATELE UNITE ALE AMERICII).

Rezultate si discutii

CVB3 (Nancy) este o tulpină de laborator utilizată în mod obișnuit pentru a studia imunopatogeneza miocarditei virale la diferite modele de șoareci [22-25]. Pentru a verifica patogenitatea virusului Wt, am folosit șoareci A/J, care sunt extrem de sensibili la infecția cu CVB3 [23,37,38]. Am observat mai întâi că șoarecii infectați cu 50 TCID50/animal au dezvoltat miocardită și pancreatită însoțită de necroză, așa cum sa raportat anterior [22,23,25].

Deoarece CVB3 este un virus ARN și genomul viral este predispus la erori în timpul trecerii continue în condiții experimentale [39], am căutat să generăm clona infecțioasă a ADNc a virusului pentru a obține un virus cu o secvență de genom conservată pentru experimentări ulterioare. Pentru a realiza acest lucru, am asamblat clona ADNc de lungime completă, pBRCVB3, din doi ampliconi derivați de RT-PCR care se întind pe întreaga lungime a genomului viral. Fragmentele PCR au fost donate în vectorul pBR322 pentru a genera clona de lungime completă (Fig. 1). Secvențierea a trei clone individuale de lungime completă a dus la derivarea secvenței virale consens care poartă 7399 nts (NCBI AC_JX312064.1).

Am comparat apoi secvența clonei noastre infecțioase, pBRCVB3, cu secvențele genomului CVB3 (tulpina Nancy) publicate anterior [16,18,21]. Am observat modificări în 15, 61 și 23 nts corespunzătoare AC_M33854.1, AC_M16572.1 și respectiv AC_JN048468.1 (Tabel S1), dar astfel de modificări sunt de așteptat [17,18,21]. Apoi am derivat o secvență consens din cele trei de mai sus și am comparat-o cu secvența pBRCVB3, ceea ce ne-a determinat să identificăm 20 nts care erau diferite. Acestea includeau cinci NT-uri în NTR-uri (patru în NTR-ul 5 ’și unul în NTR-ul 3’); 11 nts în regiunile proteice structurale (una în VP4, câte trei în VP2 și VP3 și patru în VP1); și patru nts în regiunile proteice NS (două în 2C și câte una în 3A și 3D; Tabelul 2). Trei dintre acestea nu au fost raportate anterior: C97U în 5 ’NTR; A4327G, silențios, în proteina 2C; și C5088U, rezultând înlocuirea P1449L, în proteina 3A (Tabelul 2).