fundal

Optimizarea condițiilor de cultură pentru exprimarea și producerea unor substanțe biologice terapeutice importante precum proteine ​​recombinante, fragmente de anticorpi și proteine ​​de fuziune este un element cheie în fabricarea rapidă și rentabilă a acestor molecule importante [1]. Factorii care trebuie luați în considerare atunci când se produc proteine ​​din microorganisme precum Saccharomyces cerevisiae sau Pichia pastoris includ: pH, temperatură, surse de carbon și azot și necesarul esențial de oxigen. Cererea de oxigen de către un microorganism poate fi satisfăcută prin aerarea mediului în care crește, ceea ce se face cel mai adesea prin pulverizarea de aer steril prin mediu.

Un efect nefericit atât al gazelor de spargere prin cultura mediatică la viteze ridicate, cât și a agitației intense este formarea de spumă. Aceasta este o problemă specială atunci când speciile active la suprafață, cum ar fi proteinele, sunt prezente la concentrații mari. Spumele sunt dispersii gazoase/lichide cu un conținut de gaz> 95% [2]. Formarea spumei poate reduce eficiența schimbului de gaze la suprafața culturii, deoarece se formează o barieră între cultură și gazele din spațiul principal al vasului. Spumarea poate fi, de asemenea, dăunătoare celulelor: atunci când bulele izbucnesc, exercită forțe pure, care pot deteriora celulele și/sau orice proteine ​​secretate.

În plus, celulele și mediul de cultură se pierd în faza de spumă, ceea ce poate duce la o scădere a productivității procesului. În cazuri extreme, o situație de „spumă” poate duce la pierderea sterilității procesului [2].

Pentru a minimiza efectele dăunătoare ale spumării, se utilizează agenți antispumă care previn formarea spumei prin reducerea tensiunii superficiale a culturii [1]. Există o gamă largă de agenți antispumă disponibili de la diverși furnizori. Exemple de anti-spume utilizate în mod obișnuit includ compuși din următoarele tipuri chimice: polialchilenglicoli, esteri de acizi grași alcoxilați pe baze vegetale, polipropilen glicol (PPG), polimeri siloxani, uleiuri minerale și silicați.

Pentru această investigație o proteină recombinantă secretată exprimată de ambele P. pastoris și S. cerevisiae a fost folosit ca un marker al randamentului de producere a proteinelor. Proteina produs a fost produsă utilizând următoarele sisteme de expresie; în P. pastoris gena fusese introdusă într-o casetă de expresie inductibilă cu metanol. În S. cerevisiae Expresia proteinei (tulpina autotrofă Uracil) a fost sub controlul TPI1 promotor. Proteina în sine are o greutate moleculară de aproximativ 48 kDa.

Am examinat eficacitatea a patru agenți antispumă; Schukt & Schelinger's Struktol SB2121 (Polyalkylenglycol), Schill & Schelinger's Struktol J673A (un ester alcoxilat de acizi grași pe o bază vegetală), Sigma Antifoam C (polimer siloxan) și Fluka P2000 (Polypropylene glycol), pentru utilizare cu ambele P. pastoris și S. cerevisiae. Efectul asupra ratei de creștere și a randamentului producției de proteine ​​pentru toate tipurile de antispumă la concentrații variabile a fost determinat prin monitorizarea creșterii și producția țintă de proteine ​​în S. cerevisiae și P. pastoris.

Rezultate

Diferitele tipuri de anti-spumă afectează S. cerevisiae și P. pastoris creșterea în diferite moduri, în funcție de concentrația și tipul de mediu utilizat. Când Struktol J673A este utilizat cu mediu YPD pentru P. pastoris creșterea, creșterea concentrației antispumă crește densitatea optică (DO) la 595 nm (vezi Figura 1). În schimb, atunci când Struktol SB2121 este utilizat cu mediu SD -URA pentru S. cerevisiae (tulpină: ALCOFREE ™ Yeast 01) [3] producția de proteine, creșterea concentrației antispumante reduce măsurătorile OD ale culturilor (vezi Figura 2). Când Antifoam C este utilizat cu mediu YPD, creșterea S. cerevisiae nu este afectată de concentrațiile de Antifoam C de până la 8% (vezi Figura 3). Efectul asupra producției de proteine ​​este mai puțin variabil, tendința fiind că concentrațiile de peste 1% din volumul total scad randamentul proteinei recombinate în culturi (a se vedea figura 4).

evaluarea

Curbele de creștere pentru P. pastoris în mediu YPD la 30 ° C cu antispumant J673A.