Affiliation College of Public Health, The Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

rezistenței

Afiliere Davis Heart & Lung Research Institute, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Affiliation College of Public Health, The Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Affiliation College of Public Health, The Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru fiziologie și biologie celulară, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afiliere Davis Heart & Lung Research Institute, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Affiliation College of Public Health, The Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afilieri Davis Heart & Lung Research Institute, Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biochimie Moleculară și Celulară, Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afilieri Davis Heart & Lung Research Institute, Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biochimie Moleculară și Celulară, Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru fiziologie și biologie celulară, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afiliere Davis Heart & Lung Research Institute, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afilieri Davis Heart & Lung Research Institute, Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Biochimie Moleculară și Celulară, Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

Afilieri College of Public Health, The Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii, Davis Heart & Lung Research Institute, The Ohio State University, Columbus, Ohio, Statele Unite ale Americii

  • Xiaoquan Rao,
  • Jixin Zhong,
  • Xiaohua Xu,
  • Brianna Jordan,
  • Santosh Maurya,
  • Zachary Braunstein,
  • Tse-Yao Wang,
  • Wei Huang,
  • Sudha Aggarwal,
  • Muthu Periasamy

Cifre

Abstract

Citare: Rao X, Zhong J, Xu X, Jordan B, Maurya S, Braunstein Z și colab. (2013) Exercițiul protejează împotriva rezistenței la insulină indusă de dietă prin reglarea descendentă a proteinelor kinazei Cβ la șoareci. PLOS ONE 8 (12): e81364. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081364

Editor: Cedric Moro, INSERM/UMR 1048, Franța

Primit: 18 iunie 2013; Admis: 11 octombrie 2013; Publicat: 9 decembrie 2013

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de ES018900 către Dr. Qinghua Soare. Finanțatorul nu a avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Finanțatorul nu a avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Dr. Qinghua Sun este membru al consiliului de redacție PLOS ONE. Acest lucru nu modifică aderarea autorilor la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale.

Introducere

Diabetul zaharat, în special diabetul de tip 2, este una dintre cele mai frecvente boli cronice la nivel mondial [1]. Diabetul este în creștere la nivel mondial atât ca număr, cât și ca semnificație, datorită creșterii dezvoltării economice și a urbanizării. S-a raportat că diabetul afectează 366 de milioane de oameni la nivel global în 2011 și se preconizează că acest număr va crește la 552 milioane până în 2030 atât în ​​țările dezvoltate, cât și în țările în curs de dezvoltare [2].

Numeroase studii au arătat că o dietă bogată în grăsimi (HFD) și un comportament sedentar cresc riscul obezității și rezistenței la insulină, în timp ce activitatea fizică crescută reduce acest risc [13], [14], [15], [16]. Mecanismul potențial prin care exercițiile fizice atenuează rezistența la insulină indusă de HFD implică creșterea sensibilității la insulină și a transportului glucozei în mușchii scheletici contractanți [17]. Cu toate acestea, mecanismele moleculare de bază nu sunt pe deplin înțelese din cauza proceselor complicate implicate în exercițiu [17]. Având în vedere rolul regulator important al PKCβ în rezistența la insulină, am postulat că acesta ar putea juca și un rol în îmbunătățirea rezistenței la insulină indusă de efort. Astfel, am folosit șoareci knockout PKCβ și un model de obezitate indusă de dietă pentru a testa această ipoteză. Din câte știm, acesta este primul studiu care demonstrează rolul PKCβ în rezistența la insulină atenuată la efort prin utilizarea șoarecilor cu deficit de PKCβ.

Metode

Animale și dietă

Producția de șoareci PKCβ -/- în fundalul C57BL/6J și determinarea genotipică au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [18]. La vârsta de patru săptămâni, șoarecii PKCβ -/- și de tip sălbatic (WT) C57BL/6J au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) conținând 42% din calorii din grăsimi (TD88137, Harlan, Madison, WI). La vârsta de 12 săptămâni, atât șoarecii WT, cât și șoarecii PKCβ -/- au fost repartizați aleatoriu în grupul sedentar (SED) sau exercițiu (EX) timp de 8 săptămâni (Figura S1). Toți șoarecii au avut voie să mănânce și să bea ad libitum pe toată durata studiului. Șoarecii au fost adăpostiți pe un ciclu de lumină-întuneric de 12-12 ore într-un vivariu controlat de temperatură și umiditate. Liniile directoare ale Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator au fost respectate cu strictețe și toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea de Stat din Ohio.

Intervenție de exercițiu

Intervenția de exercițiu a fost efectuată așa cum sa descris anterior [19]. Pe scurt, șoarecii din grupul de exerciții au fost antrenați cu exerciții pe o bandă de alergare motorizată (Columbus Instruments, Columbus, OH) la o viteză de 15 m/min, 40 min/zi și 5 zile/săptămână timp de 8 săptămâni. Șoarecii din grupul SED au fost puși pe aceeași bandă de alergare fără a alerga 40 min/zi și 5 zile/săptămână timp de 8 săptămâni.

Greutatea corporală, greutatea țesuturilor, aportul de alimente și aportul de apă

Greutatea corporală, aportul de alimente și aportul de apă au fost înregistrate săptămânal în timpul intervenției de efort. La 24 de ore de la sfârșitul intervenției de efort, toți șoarecii au fost postiti peste noapte și eutanasiați prin supradozaj de inhalare a CO2. S-au obținut probe de sânge, iar plasma a fost colectată și depozitată imediat la -80 ° C. Inima, ficatul, mușchii gambei (gastrocnemius și soleus), mușchiul coapsei (cvadriceps femoral și adductor magnus), grăsimea epididimală, grăsimea inghinală, împreună cu țesutul adipos maro din depozitul interscapular au fost excizați cu atenție. Toate probele de țesut au fost cântărite și apoi congelate imediat în azot lichid.

Imagistica prin rezonanță magnetică (RMN)

Masa de grăsime corporală (cavitatea abdominală) a fost evaluată prin RMN in vivo, așa cum s-a descris anterior [19]. Pe scurt, a fost utilizat un sistem de RMN vertical cu alezaj mic de 11,7 T (BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germania). În primul rând, șoarecele a fost anesteziat cu izofluran (1,5-2,0%) și plasat într-o bobină cușcă de 30 mm. După ce mouse-ul a fost poziționat în scaner, a fost utilizată o secvență de localizare a eco-spinului coronal pentru identificarea ambilor rinichi. În cele din urmă, de la polul superior al rinichiului superior până la aspectul caudal al șoarecelui, au fost obținute treizeci de felii axiale adiacente de 1 mm grosime folosind o secvență de spin-ecou cu o dimensiune de 256 × 256 pixeli (30 × 30 mm). Datele au fost analizate de software-ul National Institutes of Health Image J.

Testul de toleranță la glucoză (GTT) și testul de toleranță la insulină (ITT)

După 8 săptămâni de intervenție la efort, un test de toleranță la glucoză (post peste noapte) și testul de toleranță la insulină (post de 6 ore) au fost efectuate la toți șoarecii, așa cum s-a descris anterior [20]. Pe scurt, șoarecii au fost cântăriți și apoi injectați intraperitoneal fie cu glucoză (2 mg/kg greutate corporală), fie cu insulină (0,5 U/kg greutate corporală). Probele de sânge au fost colectate prin vena cozii și concentrațiile de glucoză au fost măsurate înainte și la 30, 60, 90 și 120 de minute după provocare pe un glucometru Elite (Bayer, Leverkusen, Germania). Suprafața de sub curbă a fost calculată utilizând software-ul GraphPad.

Evaluarea nivelului de insulină plasmatică, leptină, adiponectină și rezistență la insulină

După post peste noapte, probele de sânge au fost colectate în tuburi acoperite cu EDTA și plasma a fost colectată după centrifugare la 2000 × g timp de 15 min. Nivelul de insulină plasmatică a fost determinat în urma unui protocol standard al unui kit ELISA de insulină de șoarece cu ultrasunete (Crystal Chem, Downers Grove, IL) [21]. Nivelul de leptină a fost determinat în urma unui protocol standard al kitului ELISA Quantikine Mouse Leptin (R&D, Minneapolis, MN). Nivelul adiponectinei a fost măsurat în conformitate cu instrucțiunile producătorului folosind kitul Quantikine Mouse Adiponectin/Acrp30 ELISA (R&D, Minneapolis, MN). Rezistența la insulină (IR) a fost calculată utilizând metoda de evaluare a modelului homeostaziei (HOMA) bazată pe formula [22].

Măsurători ale consumului de oxigen și producției de CO2

Consumul de oxigen și producția de CO2 au fost măsurate simultan pentru fiecare mouse folosind un sistem de monitorizare completă a animalelor de laborator (CLAMS) controlat de computer (Columbus Instruments, Columbus, OH) [23]. Fiecare șoarece a fost măsurat individual într-o stare de odihnă timp de 24 de ore la 22 ° C în prezența hranei și a apei sau măsurat individual când rulează pe o bandă de alergat la o viteză de 15 m/min timp de 40 de minute.

Măsurarea biomarkerilor inflamatori ai sângelui

La sfârșitul studiului, sângele a fost colectat și plasma a fost stocată la -80 ° C pentru analiza citokinelor. Nivelurile plasmatice de TNF-α, IFN-γ și proteina chimiotratantă monocitică 1 (MCP-1) au fost măsurate folosind kitul 6-Plex Inflammation Mouse de la BD Bioscience (San Diego, CA), conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile de citokine au fost apoi determinate folosind un instrument BD LSR II și analizate de software-ul BD CBA (BD Biosciences, San Jose, CA) [21].

Microscopie electronică de transmisie

Pentru a investiga modificările mitocondriale in situ între grupuri, am examinat ultrastructura mitocondriilor prin microscopie electronică cu transmisie (TEM) așa cum s-a descris anterior [19]. Pe scurt, țesutul muscular a fost excizat în bucăți mici (aproximativ 1 mm 3) și fixat în 2,5% gluteraldehidă (0,1 M tampon fosfat, pH 7,4) timp de 3 ore. Apoi, fiecare specimen a fost post-fixat în 1% tetroxid de osmiu timp de 1 oră și deshidratat printr-o serie de etanol gradat (50-100%). După încorporare în rășină eponat 12, secțiuni la o grosime de 80 nm au fost tăiate și colorate cu acetat de uranil apos 2% urmat de citrat de plumb. Grilele au fost încărcate și observate într-un microscop electronic cu transmisie Tecnai G2 Spirit (FEI, Hillsboro, OR). Imaginile mitocondriilor au fost surprinse la o mărire de 18.500 ×. Pentru analiza morfometrică, s-au numărat cinci micrografii pe țesut. Mărimea și numărul mitocondrial au fost analizate de software-ul National Institutes of Health Image J.

Imunoblotarea

Țesuturile șoarecilor au fost colectate după post peste noapte. Lizatele de țesut din mușchiul soleului și ficatul au fost preparate într-un tampon de liză conținând 50 mM Tris · HCI (pH 8,0), 2 mM EGTA, 1% SDS și inhibitori de protează. După ajustarea concentrației de proteine, probele au fost încărcate și proteinele au fost separate prin electroforeză cu gel SDS/PAGE 10% și transferate la membrana PVDF. Membranele au fost incubate cu anticorpi primari specifici împotriva PKCα, PKCλ (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY), phospho-AKT, AKT (Cell Signaling Technology, Danvers, MA; 1∶1000 dilution), PKCβ, PKCδ, PKCε, β- actină (Santa Cruz, Santa Cruz, CA; diluție 1 200) și GAPDH (eBioscience, San Diego, CA; diluție 1 000), urmată de vizualizare utilizând anticorpi secundari specifici conjugați cu peroxidază de hrean. Toate benzile imunoreactive au fost detectate prin setul de substrat SuperSignal (Thermo Fisher, Rockford, IL).

Analize de date

Toate datele sunt exprimate ca mijloace ± SEM, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Diferența dintre două grupuri a fost testată prin testul t al elevului. Diferențele între grupuri au fost testate prin ANOVA bidirecțional și testul post hoc al lui Boneferroni folosind GraphPad Prism ver. 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Valorile P din Figura 1. Exprimarea izoformelor PKC la HFD și la șoareci exercitați.

A, Expresii de izoforme PKC în ficat. Șoarecii de tip sălbatic (WT) hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) au fost fie exercitați (EX), fie sedentar (SED) timp de 8 săptămâni. Ficatul a fost izolat și utilizat pentru detectarea Western blot a izoformelor PKC (panoul superior, imagini reprezentative; panoul inferior, analiza statistică). *, Șoarecii P -/- au fost mai mici decât șoarecii WT corespunzători (WT SED 41,2 ± 4,2 g față de PKCβ -/- SED 36,6 ± 5,4 g, p -/- EX 35,6 ± 2,1 g, p -/- și sedentar Șoareci PKCβ -/- (Figura 2A) Creșterea totală în greutate a șoarecilor WT sedentari a fost semnificativ mai mare decât în ​​alte grupuri, în timp ce nu s-a observat nicio diferență semnificativă în creșterea în greutate între WT exercitat și șoareci PKCβ -/- exercitați (WT SED 16,3 ± 1,2 g vs. WT EX 11,9 ± 1,7 g vs. PKCβ -/- SED 12,4 ± 1,7 g vs PKCβ -/- EX 8,2 ± 1,6 g, șoarecii p -/- au fost similari cu cei ai șoarecilor WT (Aport alimentar: WT SED 3,14 ± 0,06 g vs. WT EX 3,08 ± 0,02 g vs. PKCβ -/- SED 3,12 ± 0,07 g vs PKCβ -/- EX 3,17 ± 0,07 g, p> 0,05; Aport de apă: WT SED 3,10 ± 0,04 mL vs. WT EX 3,33 ± 0,15 mL față de PKCβ -/- SED 3,22 ± 0,06 mL față de PKCβ -/- EX 3,50 ± 0,04 mL, p> 0,05; Figurile 2C și 2D).

A, Efectul exercițiului asupra greutății corporale a șoarecilor WT și PKCβ -/-. Șoarecii au fost cântăriți o dată pe săptămână în timpul perioadei de antrenament. B, Creșterea în greutate a șoarecilor WT și PKCβ -/- în timpul perioadei de antrenament. Creșterea în greutate a fost mai mică la șoarecii WT, dar nu la șoarecii PKCβ -/- după efort. C & D, aportul de alimente (C) și aportul de apă (D) al șoarecilor WT și PKCβ -/- cu sau fără efort. WT, de tip sălbatic; EX, exercițiu; SED, sedentar; Datele sunt prezentate ca medie ± SEM; n = 8 pentru fiecare grup; *, P -/-; #, P -/- șoareci. În comparație cu controalele WT, șoarecii PKCβ -/- (atât exersați, cât și sedentari) au avut greutăți ușor crescute ale țesutului mușchilor scheletici și au redus semnificativ greutatea țesutului de grăsime inghinală, grăsime epididimală și grăsime brună intercapulară. Greutatea ficatului la șoarecii WT sedentari a fost, de asemenea, mai mare decât cea a șoarecilor sedentari PKCβ -/-, în timp ce nu s-a observat nicio diferență semnificativă în greutatea ficatului în rândul altor grupuri (Figura 3A). Rezultate similare ale greutății țesuturilor au fost obținute atunci când s-a normalizat cu greutatea corporală (Figura 3B). În mod consecvent, scanările RMN au sugerat, de asemenea, că atât masele de grăsime viscerale, cât și cele subcutanate ale șoarecilor PKCβ -/- au fost mai mici decât cele ale șoarecilor WT (Figurile 3C și 3D)

A - D, inflamație adipoasă la șoareci WT și PKCβ -/- cu sau fără efort. Exercițiul a redus ușor infiltrarea macrofagelor, deși nu este semnificativă statistic. Procentul de macrofage în SVF a fost semnificativ mai mic la șoarecii PKCβ -/-. Macrofagele cu fenotip M1 sau M2 nu au fost afectate de efort sau deficit de PKCβ. A, grafice citometrice de flux reprezentative ale macrofagelor de țesut adipos; B, analize statistice de flux ale macrofagelor țesutului adipos; C, Procentul de macrofage activate clasic (M1, CD11b + CD11c +) în macrofage de țesut adipos; D, Procentul de macrofage activate alternativ (M2, CD11b + CD204 +) în macrofage de țesut adipos. E - G, niveluri de citokine plasmatice la șoareci WT și PKCβ -/- cu sau fără efort. Plasma izolată din șoareci de efort sau sedentari a fost colectată pentru detectarea inflamatorie a citokinelor folosind kitul de inflamare a șoarecilor cu citometrie BD ™ Cytometric Bray Array. Exercițiul fizic și deficitul de PKCβ nu afectează nivelul plasmatic al IL-6, IL-10 și MCP-1. E, nivel plasmatic IL-6; F, plasmă IL-10 Nivel; G, nivel MCP-1 plasmatic. WT, de tip sălbatic; EX, exercițiu; SED, sedentar; Datele sunt prezentate ca medie ± SEM; n = 5, *, șoareci P -/- și șoareci PKCβ -/- sedentari în comparație cu șoarecii WT sedentari. Rezultate similare s-au găsit la nivelul mușchiului scheletic (Figura 8B).