Instrumente

Urmăriți jurnalul

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Informatică, Wayne State University, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Corespondenţă

A. Bollig - Fischer, Barbara Ann Karmanos, Cancer Institute, 4100 John R. St. Detroit, MI, 48201, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Informatică, Wayne State University, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Departamentul de Oncologie, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, SUA

Corespondenţă

A. Bollig - Fischer, Barbara Ann Karmanos, Cancer Institute, 4100 John R. St. Detroit, MI, 48201, SUA

Abstract

Abrevieri

1. Introducere

În ultimii 25 de ani, prevalența obezității s-a dublat în 70 de țări, inclusiv în Statele Unite, iar aproape o treime din adulții din întreaga lume sunt acum supraponderali sau obezi (Afshin și colab., 2017). Creșterea pandemiei obezității este decisiv îngrijorătoare, deoarece obezitatea este un factor de risc cunoscut pentru o serie de boli cronice, debilitante sau care pun viața în pericol (OMS, 2000), cum ar fi artrita reumatoidă, diabetul zaharat de tip 2, bolile cardiovasculare și cancerul., 2000). Bazarea asocierii de risc între obezitate și aceste boli este acumularea de țesut adipos în exces care provoacă un răspuns imun înnăscut care provoacă inflamații cronice locale și sistemice, ale căror caracteristici includ niveluri crescute de citokine proinflamatorii, producând o producție crescută de radicali liberi, inclusiv reactivi specii de oxigen (ROS) (Crujeiras și colab., 2013; Гривенников și colab., 2010; Rocha și Libby, 2009; Wellen și Hotamisligil, 2005).

2. Materiale și metode

2.1 Testarea asocierilor dintre nivelurile de expresie a tumorii MBD2_v2 și rezultatele pacienților și indicele de masă corporală (IMC)

2.2 Liniile celulare, condițiile de cultură și testul de formare a mammosferei

Liniile celulare triple-negative ale cancerului de sân MDA - MB - 468 și MDA - MB - 231 au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, SUA) și cultivate în mod obișnuit în 10% FBS Mediul Eagle modificat de Dulbecco, la 37 ° C, 5% CO2. Linia de celule SUM149 TNBC, dezvoltată și achiziționată de la Stephen Ethier (Forozan și colab., 1999), a fost cultivat în 5% FBS HAM F - 12 medii conținând 1 μg · mL -1 hidrocortizon și 5 μg · mL −1 insulină umană. Aceste trei linii celulare reprezintă subtipul molecular TNBC. Liniile celulare au fost autentificate prin scurtă analiză repetată în tandem utilizând sistemul PowerPlex (r) 16 de la Promega (Madison, WI, SUA). Prezența și capacitatea de auto-reînnoire a CSC-urilor au fost analizate în culturile de celule TNBC folosind testul de formare a mammosferei, așa cum a fost efectuat anterior (Bao și colab., 2017), și descris în Shaw și colab. (2012). Mamosferele formate au fost numărate și raportate ca o fracțiune din numărul total de celule însămânțate (1000). Imaginile au fost realizate cu ajutorul unui microscop Eclipse TE2000 - U (Nikon, Tokyo, Japonia). Testul intracelular MAK164 (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, SUA) a fost utilizat pentru măsurarea nivelurilor de peroxid de hidrogen în celulele cultivate.

2.3 Analiza semicantitativă RT-PCR și imunoblot

2.4 Knockdown SRSF2 stabil și supraexprimare MBD2_v2 în liniile celulare

Lentivirusul - mediat, eliminarea shRNA a expresiei SRSF2 s-a făcut așa cum s-a descris anterior folosind sistemul de shRNAmir lentiviral OpenGiosystems Expression Arrest GIPZ (Bollig - Fischer și colab., 2011). Celulele MDA - MB - 468 au fost transduse cu vectori care vizează SRSF2 (nr. Cod RHS4430-98485060 și RHS4430-101104677) sau vectorul de control fără silențiere. Supraexprimarea stabilă a MBD2_v2 în celulele MDA - MB - 231 a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Bao și colab., 2017). Particulele lentivirale ambalate pentru supraexprimarea MBD2_v2 (NM015832.4) sau GFP au fost achiziționate de la Cyagen Biosciences (Santa Clara, CA, SUA).

2.5 Munca animalelor

2.6 Profilarea expresiei genomewide a tumorilor recoltate de la șoareci

2.7 Analiza statistică

Analiza statistică a fost efectuată folosind r 3.3.2 (http://www.R-project.org/). Graficele au fost generate cu r 3.3.2 sau prisma graphpad (Graphpad Software, San Diego, CA, SUA). P valorile ≤ 0,05 sunt raportate ca semnificative. Al lui Welch t‐Testul a fost aplicat la datele semicantitative RT - PCR și la analiza mammosferei. Testul Gray al diferenței în incidența cumulativă a fost utilizat pentru a evalua semnificația diferențelor observate în frecvența formării tumorilor la șoarece și timpul până la eveniment între grupurile experimentale. Testul exact al lui Fisher a fost utilizat pentru a evalua diferența în frecvența formării tumorii la o dată dată. Cele mai mici pătrate generalizate, permițând observații corelate la același animal atunci când este cazul (adică, inoculare bilaterală), evaluarea interacțiunii dintre grup și timp a fost utilizată pentru a testa dacă ratele de creștere a tumorii au fost diferite între grupurile studiate. Greutatea corporală medie pentru șoareci a fost calculată pentru patru cuști în fiecare stare, până la 6 șoareci pe cușcă, măsurată de 2-3 ori pe săptămână timp de până la 185 de zile. A fost construit un model pătratic pentru a modela datele longitudinale. Diferențele dintre grupuri la un moment dat au fost comparate folosind predictorul liniar din model și cel al unui student tTest.

3. Rezultate

3.1 Asocieri între expresia tumorii MBD2_v2 și rezultatele pacienților și IMC

Am emis ipoteza că obezitatea poate provoca o creștere a expresiei MBD2_v2 pentru a promova fenotipul inițierii tumorii CSC în celulele TNBC, stabilind un curs pentru a înțelege de ce obezitatea este un factor de risc pentru diagnosticul TNBC și rezultate slabe. Pentru a stabili plauzibilitatea ipotezei noastre, a fost o prioritate să abordăm întrebarea: Nivelurile de MBD2_v2 la specimenele tumorale ale pacienților cu TNBC se asociază cu rezultatele de supraviețuire și IMC? Analiza utilizând baza de date KM Plotter (Gyorffy și colab., 2010), testarea asocierilor dintre nivelurile de transcripție genică și supraviețuirea fără recidivă la 246 de specimene, a arătat că expresia ridicată a MBD2_v2 în tumorile pacientului cu TNBC se asociază cu rate ridicate de recidivă [raport de risc (HR) = 1,66, P = 0,05, FIG. 1A]. Baza de date KM Plotter nu are date IMC. Pentru a testa o relație între IMC-ul pacientului și expresia transcrierii tumorii, am folosit un alt set de date existent de expresie genetică bazat pe sondă care cuprinde 59 de eșantioane de TNBC cu starea cunoscută a IMC colectate la KCI (Tabelul S1). Analiza de regresie liniară a indicat faptul că există o asociere pozitivă pentru expresia MBD2_v2 și IMC (P = 0,04, corelație 0,27, Fig. 1B) și nivelurile de expresie MBD2_v2 sunt semnificativ crescute în tumorile de la pacienții cu IMC ≥ 30 comparativ cu tumorile de la pacienții cu IMC

indusă

3.2 Frecvența crescută a formării tumorii și expresia tumorii MBD2_v2 la șoarecii DIO

Aceste experimente au fost concepute pentru a compara ratele de formare a tumorii, dar masa tumorii a fost reprezentată grafic (Fig. 2D, E). Pante ascendente ale curbelor de creștere sunt similare, indicând faptul că DIO a avut un efect redus sau deloc asupra ratelor de creștere ale tumorilor MDA-MB-468 sau MDA-MB-231 stabilite. Am efectuat analize semicantitative RT - PCR ale expresiei tumorale MBD2_v2. Nivelurile MBD2_v2 au fost mai mari la tumorile recoltate de la șoareci DIO comparativ cu tumorile recoltate de la șoareci martori (P

3.3 Creșterea expresiei MBD2_v2 în celulele TNBC crește capacitatea de inițiere a tumorii

3.4 Expresia MBD2_v2 a celulei TNBC depinde de expresia SRSF2 sensibilă la antioxidanți

Se raportează că factorul de îmbinare SRSF2 este necesar pentru exprimarea variantei alternative de îmbinare a ARNm MBD2_v2 în celulele stem pluripotente umane (hPSC) (Lu și colab., 2014). Am proiectat un set de experimente pentru a examina dacă aceeași relație de reglementare între SRSF2 și MBD2_v2 există în celulele TNBC. În primul rând, am observat că expresia SRSF2 este, ca MBD2_v2 (Bao și colab., 2017), supus reglării ROS sensibile la antioxidanți în celulele TNBC. Folosind liniile celulare MDA-MB-468 și SUM149 TNBC, care au exprimat niveluri endogene abundente în mod similar de SRSF2, (-) - tratamentul cu antioxidant epicatechin a redus nivelurile ROS și MBD2_v2 (Fig. S5) și a redus nivelul de ARNm și proteine ​​al SRSF2 (Fig. 4A, B). Am stabilit apoi două knockdown-uri stabile SRSF2 independente (folosind două secvențe unice de shRNA) și nonsilențierea controlului vectorului MDA-MB-468 linii celulare. Knockdown-ul SRSF2 a dus la scăderea nivelului de proteine ​​MBD2_v2 și ARNm (Fig. 4C, D). Potrivit testelor de formare a mammosferei, eliminarea SRSF2 a dus, de asemenea, la mai puține mamosfere (Fig. 4E) și la o reducere a dimensiunii celor care au supraviețuit (Fig. 4F). În ansamblu, acest lucru caracterizează un rol pentru axa de reglementare SRSF2 - MBD2_v2 dependentă de ROS în celulele TNBC.

3.5 Expresia SRSF2 tumorală este crescută la șoarecii DIO, iar reglarea descendentă a SRSF2 împiedică capacitatea de inițiere a tumorii a celulelor TNBC

Am efectuat analize semicantitative RT - PCR pentru expresia SRSF2 în tumorile recoltate de la șoareci DIO și martori. La fel ca MBD2_v2 (Fig. 2F), nivelurile SRSF2 au fost constant mai mari în tumorile recoltate de la șoareci DIO (P 2014). Conform analizei semicantitative RT - PCR, deraparea SRSF2 s-a pierdut în tumorile stabilite (Fig. S6). În plus, expresia ridicată a SRSF2 în tumorile pacientului cu TNBC se asociază cu rate ridicate de recidivă (HR = 1,57, P = 0,04, baza de date KM Plotter, Fig. 5C). Cu toate acestea, o analiză a setului de date KCI, care a relevat o asociere între MBD2_v2 și IMC (Fig. 1B, C), nu a reușit să identifice o asociere între expresia SRSF2 și IMC (Fig. S6).

4. Discutie

Pentru experimentele concepute pentru a evalua mai direct dacă expresia crescută a MBD2_v2 și SRSF2 joacă un rol cauzal în creșterea formării tumorale, am modificat stabil nivelurile de MBD2_v2 sau SRSF2 în celulele TNBC înainte de inoculare. Supraexpresia MBD2_v2 a crescut semnificativ capacitatea de inițiere a tumorii a celulelor TNBC la șoarecii slabi și deranjarea SRSF2, care a scăzut expresia MBD2_v2, a împiedicat semnificativ capacitatea de formare a tumorii în contextul mai tumorigen al șoarecilor DIO. A fost stabilită anterior relevanța metodologiei experimentale pentru inocularea șoarecilor cu celule canceroase pentru a măsura eficiența formării tumorii sau a tumorigenicității (Al - Hajj și colab., 2003). Cercetătorii au observat că un număr relativ mic de celule care prezintă fenotipul CSC posedă capacitatea de macrocolonizare și ulterior formează tumori la șoareci, dar un număr mai mare de celule cu fenotipuri alternative, denumite celule canceroase în vrac, nu reușesc să se macrococolonizeze (Al - Hajj și colab., 2003).

5. Concluzie

Raportul actual descrie dovezi care susțin că expresia MBD2_v2 este receptivă la obezitate și determină tumorigenicitatea TNBC și, astfel, oferă informații moleculare în sprijinul dovezilor epidemiologice că obezitatea este un factor de risc pentru TNBC. Majoritatea pacienților cu TNBC sunt obezi (Trivers și colab., 2009; Vona-Davis și colab., 2008) și creșterea ratelor de obezitate amenință să crească și mai mult povara cancerelor legate de obezitate (Pearson - Stuttard și colab., 2018), care întărește relevanța acestui domeniu de studiu.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de Fondul Național de Cercetare din Qatar (NPRP7-363-33-089 acordat ABF). Centrul NIH: NCI acordă P30 CA022453 către Karmanos Cancer Institute, contribuție susținută din biostatistică, biobancare și științe corelative, și modelele animale și nucleele de evaluare terapeutică.

Conflict de interese

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Contribuțiile autorului

ABF a conceput și a supravegheat studiul. EAT și BB au efectuat experimente moleculare și celulare. LAP a supravegheat experimentele și îngrijirea animalelor. KSP a generat date despre specimenul uman. EAT, CM, GD și ABF au analizat datele. LAP, RMM, GD, KSP și ABF au oferit expertiză și materiale esențiale. EAT și ABF au scris manuscrisul cu feedback de la toți autorii. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

FIG. S1. Filme scanate cu pete de lungime completă.

FIG. S2. Analiza expresiei MBD2_v1 în tumorile pacientului.

FIG. S3. Expresia MBD2_v2 în culturi de linie celulară TNBC înainte de inocularea șoarecelui.

FIG. S4. MBD2_v2 supraexprimarea și GFP care exprimă curbele de creștere a tumorii.

FIG. S5. Efectul tratamentului (-) - epicatechinei asupra nivelurilor ROS și MBD2_v2 în culturile de celule TNBC.

FIG. S6. Nivelurile tumorii și curbele de creștere ale SRSF2 și expresia SRSF2 a tumorii pacientului legate de IMC.

FIG. S7. Adipozitatea viscerală, nivelurile de stres oxidativ și îmbogățirea genelor căii de semnalizare în tumori comparând șoarecii DIO și șoareci de control.

FIG. S8. NANOG în culturi și tumori de linie celulară TNBC.

Tabelul S1. Expresia genei tumorale a pacientului și datele IMC.

Vă rugăm să rețineți: editorul nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea oricăror informații de susținere furnizate de autori. Orice întrebări (altele decât conținutul lipsă) ar trebui să fie adresate autorului corespunzător pentru articol.

  • Afshin A, Forouzanfar MH, Reitsma MB, Sur P, Estep K, Lee A, Marczak L, Mokdad AH, Moradi - Lakeh M, Naghavi M, și colab. (2017) Efectele supraponderale și ale obezității asupra sănătății în 195 de țări de peste 25 de ani . N Engl J Med 377, 13 - 27 .

Numărul de ori citat conform CrossRef: 6

  • Ilaria Chiodi, Chiara Mondello, Factorii stilului de viață, plasticitatea celulelor tumorale și celulele stem canceroase, Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 10.1016/j.mrrev.2020.108308, (108308), (2020).

MBD2 se corelează cu o prognoză slabă și o progresie tumorală în carcinomul cu celule renale