Abstract

fundal

Studiile epidemiologice sugerează că hiponutriția în timpul perioadei fetale crește riscul de tulburări mentale, cum ar fi tulburarea de hiperactivitate cu deficit de atenție și tulburarea spectrului autist, care a fost susținută experimental folosind modele animale. Cu toate acestea, hiponutriția experimentală anterioară sau dietele cu restricție de proteine ​​(PR) au afectat alte stadii decât stadiul fetal, cum ar fi formarea oului înainte de inseminare, compoziția laptelui în timpul alăptării și comportamentul matern alăptării.

Rezultate

Am efectuat fertilizarea in vitro și transferul de embrioni la șoareci și am permis ca dieta PR și dieta PR suplimentată cu acid folic să afecteze numai mediile fetale. Fenotiparea cuprinzătoare a descendenților PR și a dietelor de control a arătat diferențe moderate în comportamentele asemănătoare fricii/anxietății, în căutarea de noutate și prosociale, indiferent de suplimentarea cu acid folic. Modificări au fost, de asemenea, detectate în expresia genelor și metilarea genomică în creier.

Concluzii

Aceste rezultate sugerează că factorii epigenetici din embrion/făt influențează fenotipurile comportamentale și epigenetice ale descendenților. Modificări epigenetice semnificative la nivelul creierului progeniturilor induse de restricția proteinei materne au fost observate în prezentul studiu. Din câte știm, acesta este primul studiu care evaluează efectul hiponutriției materne asupra fenotipurilor comportamentale folosind tehnologia reproductivă.

fundal

Cu toate acestea, dieta PR maternă afectează nu numai mediul fetal, ci și formarea oului înainte de inseminare, starea nutrițională a laptelui matern și comportamentul de alăptare maternă și, prin urmare, are potențiale variabile de confuzie în diferite stadii. În studiul de față, am efectuat fertilizarea in vitro (FIV) pentru a produce nou-născuți și apoi am obținut progenituri care au fost adoptate de mamele adoptive înainte de înțărcare. Acest lucru a permis ca dieta PR să afecteze doar stadiul de dezvoltare fetală.

Metode

Declarație etică a experimentelor pe animale

Toate procedurile descrise aici au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din filiala RIKEN Tsukuba și au fost efectuate în conformitate cu principiile directoare RIKEN pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (nr. 10-013).

Proiectare experimentală

după

Strategia experimentală. Proiectul experimental al acestui studiu este descris pe scurt. Dieta normală (CE-2) a fost hrănită la femelele folosite pentru colectarea ovocitelor și la bărbații folosiți pentru colectarea spermei. Mamele primitoare au consumat dieta de control (CD) sau dieta experimentală (PR și FA) timp de 1 lună înainte de transferul embrionului. Embrionii au fost generați prin fertilizarea ouălor cu spermă de șoareci C57BL/6J (B6). După nașterea prin cezariană, nou-născuții au fost încurajați de femele ICR care au consumat diete CD, PR sau FA. După înțărcare, descendenții au consumat dieta de control (CD). Serul a fost separat de sângele prelevat de la femelele ICR. Țesutul cerebral a fost colectat de la descendenți după testele de comportament

Dietele experimentale

CD-ul a fost foarte asemănător cu formarea standard a AIN93G [15]. Dietele testate au fost modificate din formularea AIN93G după cum urmează: PR, raportul cazeinei fără vitamine a scăzut de la 20 la 5%; FA, s-au adăugat 0,8 g/kg de acid folic la PR (Tabelul 1). CD și PR conțineau 0,02% acid folic (compoziție în greutate) și FA conținea 0,1% acid folic (compoziție în greutate). Dietele experimentale au fost achiziționate de la un furnizor comercial (Oriental drojdie Co. Ltd, Tokyo, Japonia). Aceste diete au fost izocalorice (4 kcal/g în fiecare furaj) și au fost hrănite mamelor destinatarilor ad libitum. În plus, doar dieta CD a fost hrănită mamelor adoptive ad libitum.

Toți șoarecii utilizați ca mamă primitoare și adoptivi, precum și pentru colectarea ovulelor și spermei, au fost cumpărați de la un furnizor comercial (CLEA Japan, Inc.).

Fecundarea in vitro și transferul embrionilor

Test clinic-biochimic

Am efectuat un test clinic-biochimic folosind ser colectat de la femele ICR la vârsta de 13 săptămâni. Șoarecii au consumat diete experimentale timp de 7 săptămâni. Recoltarea sângelui, separarea serului și analiza au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [20]. Pe scurt, am colectat 200 μl de sânge din sinusul retro-orbital folosind o pipetă Pasteur (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Sângele colectat a fost transferat într-un microtub care conține soluție de coagulant Wako (Wako Pure Chemical Industries Co, Osaka, Japonia) și serul a fost separat prin centrifugare de două ori (600-2500 ×g timp de 5–15 min). Am măsurat proteinele totale (TP), azotul ureei (UN), albumina (ALB), colesterolul total (T-CHO), HDL-colesterolul (HDL-C), trigliceridele (TG) și LDL-colesterolul (LD-C) în ser cu un analizor clinic-biochimic automat (JCA-BM2250, JEOL, Ltd., Tokyo, Japonia). Numărul de subiecte: CD, 7; PR, 7; FA, 6.

Extracția ADN/ARN

Am recoltat creiere întregi din descendenți masculi adulți (vârsta de 19 săptămâni) care au fost folosiți în analize comportamentale, analize de metilare și matrice de expresie. Bărbații adulți au fost eutanasiați prin luxația cervicală. Probele de creier au fost clătite cu PBS și congelate imediat folosind azot lichid. Țesuturile înghețate au fost depozitate la -80 ° C. ARN și ADN au fost extrase simultan folosind un mini kit AllPrep ADN/ARN (Qiagen, Valencia, CA, SUA) din întregul creier, inclusiv cerebrul și cerebelul. Am efectuat apoi metilarea genelor și matrici de expresie așa cum este descris mai jos.

Metilare genomică

Analiza metilării ADN-ului la nivelul genomului a fost efectuată după cum sa raportat anterior, cu ușoară modificare [21]. ADN-ul genomic a fost fragmentat cu enzime de restricție insensibile la metilare (MseEu, BfaEu si CSP6I) pentru a produce fragmente cuprinse între 200 și 1000 de perechi de baze. Îmbogățirea ADN-ului metilat a fost realizată folosind kitul de îmbogățire a ADN-ului metilat MethylMiner (Thermo Fisher Scientific Inc.). Pe scurt, ADN metilat dens CpG a fost izolat din ADN genomic fragmentat prin legarea la domeniul metil-CpG al proteinei MBD2, care este cuplată la streptavidina Dagnabeads M-280 paramagnetică printr-un linker de biotină. O parte din ADN-ul fragmentat (intrare) a fost lăsată netratată și utilizată ca control. ADN-ul a fost amplificat și curățat folosind kitul GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) și kitul de curățare GenElute PCR (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, SUA). Pentru analiza metilării genomice, am folosit Mouse Promoter 1.0R Array (Affymetrix) împotriva metilării (IP) și a intrării ADN (IN). Numărul de subiecte: CD, 3; PR, 4; FA, 4.

Expresie matrice

Analiza expresiei prin microarray de ADN a fost efectuată cu sistemul Agilent (G4846A; Whole Mouse Genome Microarray Kit (4x44K) Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Sondele pentru microarray au fost pregătite și etichetate de Cy3 conform protocolului producătorului (Agilent Technologies). Tablourile au fost scanate cu un sistem de scanare Microarray G2505C (Agilent Technologies). Datele au fost normalizate folosind R pachet statistici cu funcția qspline a pachetului „affy” din Bioconductor [22].

Valabilitatea datelor matricei de metilare și expresie

Rezultatele analizelor de metilare au fost validate în studii anterioare [21, 23]. În aceste studii, datele de cuantificare a metilării bazate pe matrice au arătat o concordanță puternică cu rezultatele obținute din secvențierea bisulfitului (r = 0,81 până la 0,88) [21, 24]. În plus, datele matricei de expresie au fost validate și în studii anterioare. Datele de expresie obținute de platforma microarray cu o singură culoare au arătat o concordanță puternică cu un test TaqMan (r = 0,876) într-un proiect de control al calității microarray-ului la scară largă [25].

Disponibilitatea datelor

Datele matricii de expresie și metilare au fost depuse în omnibusul de expresie genică NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), iar numerele de acces ale seturilor de date sunt după cum urmează: GSE79847.

Teste comportamentale

Am efectuat următoarele teste comportamentale: test în câmp deschis (6 săptămâni), test de explorare a obiectelor (7 săptămâni), test de interacțiune socială (8 săptămâni), test de activitate în cușcă la domiciliu (9 până la 10 săptămâni), test de tranziție ușoară/întunecată (vârstă de 11 săptămâni), test de condiționare a fricii (vârstă de 12 săptămâni) și test de suspensie a cozii (vârstă de 13 săptămâni). Rezultatele testelor comportamentale sunt sensibile la experiențele anterioare [26]. Pentru a suprima efectele experiențelor anterioare, testele comportamentale au fost efectuate în ordinea unei stimulări mai reduse, așa cum s-a descris mai sus. Am folosit șoareci masculi pentru testele comportamentale pentru a elimina efectele ciclului estru la femele. Numărul de subiecte: CD, 10; PR, 10; FA, 7.

Test în câmp deschis

Testul în câmp deschis a fost efectuat așa cum s-a descris anterior [27]. Fiecare șoarece a fost plasat în colțul unui aparat în câmp deschis (400 mm lățime × 400 mm lungime × 300 mm înălțime; O'Hara & Co., Ltd., Tokyo, Japonia) din clorură de polivinil alb. Distanța parcursă de fiecare animal în câmp deschis a fost înregistrată timp de 20 de minute cu un sistem de imagistică video (Imagine OF9; O'Hara & Co., Ltd.).

Test de explorare a obiectelor

Am efectuat un test de explorare a obiectelor așa cum s-a descris anterior [27]. Pe scurt, fiecare șoarece a fost plasat în aparatul în câmp deschis fără obiectul nou timp de 20 de minute de aclimatizare înainte de testare. Un tub acrilic transparent (diametrul inferior, 66 mm; diametrul superior, 44 mm; înălțimea, 154 mm) conținând marmură a fost plasat în centrul câmpului deschis. Timpul total petrecut explorând obiectul și frecvența explorării pe o perioadă de 10 minute au fost determinate cu un sistem comercial de imagistică video (O'Hara & Co., Ltd.). Explorarea a fost definită ca o distanță de

Rezultate

Greutatea corporală și parametrii legați de proteine ​​ai mamelor primitoare

Efectele restricției proteinei materne asupra fenotipurilor comportamentale ale descendenților

În mod colectiv, aceste rezultate sugerează că dieta PR la mamele primitoare, indiferent de suplimentarea cu FA, îmbunătățește susceptibilitatea la frică/anxietate, căutarea noutăților și comportamentele prosociale ale descendenților.

Efectul restricției proteice asupra alterărilor epigenetice

Discuţie

În studiul de față, am examinat efectul hiponutriției materne din cauza unei diete PR asupra tulburărilor mentale și de dezvoltare ale descendenților prin fenotiparea cuprinzătoare a comportamentelor. Examenul a inclus șapte teste diferite pentru frică/anxietate, căutarea noutăților și comportamente prosociale, precum și altele care pot fi legate de comportamente asemănătoare cu AD/HD și ASD. Am găsit diferențe semnificative în testele de frică/anxietate, căutarea noutăților și comportamentele prosociale, ceea ce sugerează că factorii de mediu din embrion/făt joacă un rol important în susceptibilitatea progeniei la aceste comportamente. Acest lucru poate fi paralel cu studiile epidemiologice care arată că factorii de mediu sau nutriționali afectează simptomele comportamentale ale AD/HD [32] și ASD [33].

La fel ca într-un studiu anterior [9], studiul de față a folosit doar șoareci masculi pentru testele comportamentale pentru a elimina variația fenotipică a șoarecilor femele cauzată de desincronizarea ciclului estru. Șoarecele B6 prezintă dimorfisme sexuale în mai multe fenotipuri comportamentale, inclusiv funcția motorie în testul rotarod, învățarea și memoria în testul de labirint de apă Morris și testul de condiționare a fricii și activitatea locomotorie în testul în câmp deschis [43]. Efectele moderate ale restricției proteinei materne asupra fenotipurilor comportamentale ale progeniei observate în prezentul studiu pot fi fenomene specifice sexului.

Nivelurile de metilare ale promotorilor din aceste gene nu au fost corelate cu nivelurile de expresie ale genelor. Modificările epigenetice din creier ale progeniei induse de restricția proteinei materne au fost observate în mod clar în prezentul studiu. O legătură cauzală între modificările epigenetice și comportamentale rămâne de investigat.

Rezultatele prezentului studiu sugerează că, deși restricția proteinei materne în timpul sarcinii este un factor de risc moderat pentru tulburările de dezvoltare sau mentale ale descendenților, aceasta poate fi confirmată prin interacțiunea cu factori genetici, inclusiv mutații specifice sau variații genetice. În plus, efectele preinseminării și postnatale/lactației ale hiponutriției materne pot contribui semnificativ la fenotip.

Pentru a verifica această ipoteză, poate fi necesar să se examineze efectul expunerii hiponutriționale in utero asupra modelelor cunoscute de tulburări de dezvoltare, cum ar fi modelele AD/HD și ASD, sau alte tulpini de șoareci și să se clarifice consecințele adiționale sau interacțiunea pentru fenotipurile comportamentale.

Concluzii

Grupul PR a prezentat comportamente legate de frică/anxietate și neatenție față de un obiect nou sau un șoarece nou mai mult decât cele din grupul de dietă de control. Așa cum ar fi de așteptat, creierele adulte din grupul PR au prezentat diferențe în tiparele analizei matricii de expresie și ale metilării genomice.

Factorii de mediu din embrion/făt joacă un rol important în sensibilitatea la alterarea comportamentelor descendenților. Studiul de față este, după cunoștințele noastre, primul care evaluează efectul hiponutriției materne asupra fenotipurilor comportamentale folosind tehnologia reproductivă.

Abrevieri

Originile dezvoltării sănătății și bolilor