Editat de Kenneth I. Berns, Universitatea din Florida, Gainesville, FL și aprobat la 17 septembrie 2003 (primit pentru revizuire la 24 iunie 2003)

periferică

Abstract

Obezitatea, recunoscută de Organizația Mondială a Sănătății ca o problemă de sănătate de proporții pandemice, este o tulburare metabolică complexă de etiologie multifactorială, care duce adesea la rezistență la insulină, dislipidemie, hipertensiune arterială, afectarea fibrinolizei și numeroase alte afecțiuni patologice, inclusiv cancerele (1) . În țările occidentale, 2-8% din costurile de îngrijire a sănătății sunt atribuite obezității (2), iar această statistică este agravată de o rată slabă de tratament de succes. Până în prezent, nu a fost stabilit un tratament farmacologic eficient, deoarece medicamentele anti-obezitate actuale invocă o mulțime de efecte secundare dăunătoare (3, 4).

Printre potențialele molecule terapeutice, leptina nu a reușit să îndeplinească așteptările ca medicament ales pentru obezitatea indusă de dietă (DIO), deoarece marea majoritate a pacienților supraponderali sunt rezistenți la leptină (5). Când a fost administrată central, leptina a mediat inițial un efect anorexigenic mai robust (6), dar apoi a apărut pentru a promova dezvoltarea rezistenței la leptină centrală în creierul de șobolan expus la expresia constitutivă extinsă a transgenului de leptină (7, 8).

Metode

Animale și dietă. Șobolanii Sprague - Dawley (Harlan Breeders, Indianapolis) au fost îngrijiți în conformitate cu principiile din Ghidul Consiliului Național de Cercetare pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator (ref. 19; disponibil la http://oacu.od.nih.gov /regs/guide/guidex.htm). Șobolanii au fost adăpostiți individual la 23-24 ° C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12:12 h. Animalele au fost hrănite ad libitum cu unul dintre următoarele două tipuri de dietă, după cum s-a indicat: chow de laborator standard (12% din kcal sub formă de grăsime; Dieta de laborator, St. Louis), denumită în continuare dieta normală (ND) și dieta bogată în calorii. (60% din kcal sub formă de grăsimi; Research Diets, New Brunswick, NJ), denumită în continuare dieta bogată în grăsimi (HF).

Construcție vectorială. ADNc care codifică Acrp30 murin a fost obținut prin clonarea mediată de RT-PCR utilizând ARN total izolat din țesutul adipos alb. La verificarea secvenței, a fost identificată o mutație cu un singur punct (A 382/G) care a schimbat Met-113/Val. ADNc a fost utilizat „așa cum este”, fără a reveni reziduul înapoi la secvența raportată (9), deoarece alinierea secvenței Acrp30 murin și apM1 uman (20) a relevat prezența unui reziduu Val în poziția respectivă a ortologului uman, iar mutația a fost considerată irelevantă din punct de vedere funcțional. Vectorul rAAV care transportă ADNc Acrp30 murin a fost asamblat utilizând coloana vertebrală pTR-UF (21). Caseta de expresie transgenă cu flancuri TR conținea următoarele elemente genetice: potențator citomegalovirus/promotor β-actină de pui (22), ADNc Acrp30, element de reglare posttranscripțional al virusului hepatitei woodchuck (23) și situsul de poliadenilare a hormonului de creștere bovin.

Ambalarea, titrarea și administrarea vectorilor rAAV. Plasmida de transfer pTR-Acrp30, care conține caseta de expresie Acrp30, a fost ambalată în capside serotip AAV1 sau AAV5. Serotipurile 1 și 5 au fost produse prin procesul cunoscut sub numele de „pseudotipare” prin utilizarea respectivelor plasmide auxiliare pXYZ1 sau pXYZ5 (24), care conțin gene de capsidă AAV1 și respectiv AAV5. Vectorii au fost ambalați, purificați, concentrați și titrați așa cum este descris (24). Vectorii rAAV purificați au fost> 99% puri, măsurați prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă și colorare cu argint (datele nu sunt prezentate). Raportul mediu dintre particulele fizice și cele infecțioase a fost de 50: 1.

O doză unică de vector de 10 12 particule rezistente la DNază I la 500 μl de soluție Ringer lactată a fost administrată animalelor fie prin injecție venă portal (PVI), fie prin injecție în mușchiul cvadriceps.

Histologie. Șobolanii au fost uciși de supradozajul pentobarbital, iar serul a fost colectat. Întregul ficat a fost recoltat și cântărit. O mică porțiune a fost plasată în soluția ARNlaterală (Ambion, Austin, TX). Secțiuni de ficat, pancreas, țesut adipos și mușchi au fost recoltate pentru evaluare histopatologică de rutină. Probele de țesut au fost fixate în formalină tamponată neutră 10% peste noapte și încorporate în parafină. Secțiunile de parafină (5 μm grosime) au fost colorate cu hematoxilină și eozină și examinate pentru modificări inflamatorii sau degenerative de către un patolog care nu cunoștea grupul de tratament pentru animale.

Plasma Acrp30, Leptină și glucoză. Plasma Acrp30 a fost măsurată folosind kituri Acrp30 RIA de șoarece și șobolan (Linco Research Immunoassay, St. Charles, MO) sau kituri ELISA (B-Bridge International, Sunnyvale, CA). Alternativ, șoarecele Acrp30 a fost testat utilizând analiza Western blot (vezi mai jos). Leptina plasmatică a fost măsurată utilizând setul de panouri endocrine pentru șobolani LINCOplex (Linco Research Immunoassay).

i.p. Test de toleranță la glucoză (IP GTT). IP GTT a fost efectuat în săptămâna 27 după injectarea vectorului. După peste noapte 17-h rapid, șobolanii neanesteziați au fost injectați i.p. cu o doză de 1,5 g soluție de glucoză 50% pe kg de greutate corporală (BW). Probele de sânge au fost obținute din vena cozii înainte de provocarea glucozei și la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după provocarea glucozei. Concentrația glicemiei a fost măsurată cu un contor portabil de glucoză Elite XL (Bayer, Elkhart, IN).

Izolarea ARN-ului. ARN-ul total din ficat a fost izolat utilizând reactiv TRIzol (GIBCO/BRL). Integritatea ARN a fost verificată prin denaturarea electroforezei cu gel de agaroză (1%) cu colorare cu bromură de etidiu.

Efectul rAAV1-Acrp30 sau rAAV5-Acrp30 administrat periferic la șobolani femele DIO. Toate injecțiile, cu excepția cazului în care se indică altfel, au fost făcute intraportal. (A) Modificarea BW. (B) FI medie zilnică afișată pentru toate grupurile. Două grupuri prezintă diferențe semnificative, după cum se indică. (C) Modificare în kcal/zi ingerată. Pentru claritate, sunt prezentate doar două grupuri de șobolani. (D) Aportul caloric mediu zilnic indicat pentru toate grupurile. (E) Nivelurile de leptină plasmatică la momentul uciderii animalelor. NS, nesemnificativ statistic. (F) Parcela de eficiență a hranei pentru animale (FE), așa cum se explică în Rezultate. □, șobolani martor DIO injectați cu vector rAAV-GFP (n = 10) și alimentați cu HF; ○, șobolani de control injectați cu vector rAAV-GFP (n = 6) și alimentați cu ND; •, șobolanii s-au injectat intramuscular cu vectorul rAAV1-Acrp30 (n = 6) și au alimentat HF; ▴, șobolani injectați cu vector rAAV1-Acrp30 (n = 6) și alimentați cu HF; ♦, șobolanii injectați cu vector rAAV5-Acrp30 (n = 6) și alimentați cu HF. Creșterea hranei ingerate și a caloriilor documentate la începutul experimentului (C) este atribuită trecerii la HF, care este mai plăcută. Săgețile din A și C indică ora când IP GTT a fost efectuat.

Analiza Western blot a proteinelor din plasmă de la șobolani injectați cu rAAV1-Acrp30 sau rAAV5-Acrp30. (A) Plasma de la șobolani în ziua 40 după tratament. (B) Plasma de la șobolani uciși în ziua 297 după tratament. (C) La fel ca B, cu excepția 1: 100 diluat și hibridizat cu anticorpi anti-Acrp30 specific șobolanului. Plasma de la șoarece normal a fost utilizată ca probă de control pozitiv (diluare 1: 100 sau 1: 200). Numerele de deasupra fiecărei benzi se referă la animale experimentale individuale. (D) SDS/4-15% PAGE electroforeză cu imunoblotare ulterioară. Înainte de încărcare, plasma prepurificată de la unul dintre șobolanii rAAV5-Acrp30 a fost tratată fie în condiții reducătoare (+), fie nereducătoare (-). Plasma diluată de la șoarece, utilizată ca control pozitiv, a fost tratată în același mod. Concentrația ridicată de proteine ​​în probe de șobolan nediluate în condiții nereducătoare a dus la o mobilitate ușor aberantă a complexelor multimerice; HMW, greutate moleculară mare; MMW, greutate moleculară medie; LMW, greutate moleculară mică (24).

Biodistribuirea serotipurilor 1 și 5 rAAV pe PVI. Pentru a determina organul și țesutul țintă transduse de serotipurile vectoriale utilizate pentru livrarea genei Acrp30, mai mulți șobolani Sprague-Dawley au fost injectați intraportal cu 2 × 10 12 particule rezistente la DNază I de rAAV1-GFP sau rAAV5-GFP. Analiza PCR a ADN-ului izolat din diferite organe la 10 zile după injectare a relevat că pentru ambele serotipuri AAV testate, ficatul a fost organul în care s-a detectat cea mai mare parte a vectorului (Fig. 4). Pentru rAAV1-GFP, ADN-ul viral a fost detectat și în mușchiul scheletic. În schimb, rAAV5-GFP a fost detectat în majoritatea țesuturilor testate, cu excepția inimii și a creierului (Fig. 4 Mai jos), ceea ce indică eficiența și promiscuitatea mai ridicate ale acestui serotip. Distribuția transgenului în ficat în ambele grupuri a fost evaluată și în fiecare lob separat. Este de remarcat faptul că distribuția a fost similară pe toți lobi: lateral drept și stâng, caudat și ambii lobi mediali (datele nu sunt prezentate).

Analiza PCR a biodistribuției ADN-ului viral în țesuturile șobolanilor injectați PVI cu vectori rAAV1-GFP (superior) sau rAAV5-GFP (inferior). Fragmentele PCR de ADNc GFP (0,6 kb) au fost vizualizate prin colorare cu bromură de etidiu. Este prezentată o imagine negativă a gelului.

Examinarea histologică a ficatului. Secțiunile de ficat de la 21 de șobolani reprezentând controalele HF și ND și grupurile AAV1-Acrp30/HF și AAV5-Acrp30/HF au fost revizuite. Câțiva șobolani din grupul de control au avut inflamație mononucleară focală până la multifocală ușoară în regiunile portal sau parenchimatoase, care a fost considerată în intervalul normal de constatări în condițiile de creștere. PVI fie al rAAV-GFP, fie al rAAV-Acrp30 nu a dus la modificări ale morfologiei hepatice. Gradul de steatoză (acumularea de grăsime) a fost similar și între grupurile de control și grupurile Acrp30 (datele nu sunt prezentate).

Efectul rAAV-Acrp30 administrat intraportal asupra glucozei și a moleculelor legate de metabolizarea lipidelor în ficat. Pentru a elucida mecanismele prin care expresia ectopică a transgenului mediată de rAAV în ficat ar putea proteja împotriva dezvoltării obezității și a alterării GT, am analizat expresia genelor cheie care reglementează metabolismul glucozei și al lipidelor.

PEPCK catalizează conversia oxaloacetatului în fosfoenolpiruvat, care este etapa de limitare a ratei gluconeogenezei. Gena pentru PEPCK este exprimată în principal în ficat, cortexul renal și grăsime. Exprimarea la nivel înalt a genei PEPCK în ficat în timpul obezității și diabetului este un factor major în gluconeogeneza crescută caracteristică acestei boli (30). Folosind RQ RT-PCR, am coroborat constatarea (31) că la șobolanii Sprague - Dawley HF crește semnificativ nivelurile PEPCK (Fig. 5A). În același timp, expresia Acrp30 a redus semnificativ nivelurile de expresie ale PEPCK în ficat atât a șobolanilor injectați rAAV1-Acrp30, cât și a șobolanilor injectați rAAV5-Acrp30 (Fig. 5A). În ambele grupuri, nivelurile de expresie PEPCK au fost mai mici decât la animalele de control hrănite cu ND.

Testul RQ RT-PCR al nivelurilor de expresie ale ARNm în ficatul șobolanilor femele injectat PVI cu rAAV1-Acrp30 sau rAAV5-Acrp30. (A) Exprimarea mARN-ului PEPCK. (B) Exprimarea SREBP-1c. A și B Upper sunt imagini ale filtrelor respective cu 32 de produse RT PCR etichetate cu P, așa cum este indicat în stânga. A și B inferior sunt reprezentări grafice ale acelorași date.

SREBP-1c este un factor transcripțional major care reglează sinteza acizilor grași în ficat (32). Nivelurile SREBP-1c sunt crescute la nivelul ficatului gras al șoarecilor obezi rezistenți la insulină (33). Nivelurile crescute de SREBP-1c cresc expresia genelor lipogene, îmbunătățesc sinteza acizilor grași și accelerează acumularea de trigliceride (34). Similar cu PEPCK, nivelurile de SREBP-1c la ficatul șobolanilor hrăniți cu HF au fost crescute (Fig. 5B), în timp ce expresia Acrp30 a dus la reducerea dramatică a expresiei SREBP-1c hepatică (de 7 ori în grupul rAAV5-Acrp30 vs. grupul rAAV-GFP/ND). Prin urmare, expresia ectopică a Acrp30 reglează în jos expresia genelor cheie care controlează gluconeogeneza hepatică și lipogeneza de novo.

Discuţie

Spre deosebire de leptină, nivelurile de Acrp30 sunt reduse considerabil în timpul hiperlipidemiei (10, 11), în timp ce terapia suplimentară pe termen scurt cu Acrp30 în unele cazuri a redus masa țesutului adipos și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină (13-15). În raportul actual, am obținut efecte benefice similare pe termen lung după o singură injecție de rAAV-Acrp30.

Cea mai neașteptată constatare din studiul actual a fost concentrațiile plasmatice relativ mici de Acrp30 murin, variind de la 40 la 90 ng/ml. Acest interval a fost cu aproximativ două ordine de mărime mai mic decât nivelurile fiziologice ale șobolanului endogen Acrp30 (Fig. 3) și nu era de așteptat să producă niciun răspuns măsurabil (15). Cu toate acestea, a generat un efect metabolic sistemic, suficient pentru a contracara câștigul de adipozitate indus de dietă. Se pare că s-a obținut un efect local la nivel hepatic asupra interacțiunii autocrine și/sau paracrine a Acrp30 exogen cu AdipoR2. În ciuda originii ectopice, Acrp30 exogen a fost totuși capabil să formeze structuri de ordin superior (Fig. 3D) care au fost importante pentru secreția adecvată și funcțiile fiziologice (25).

Biodistribuirea serotipurilor vectoriale testate (Fig. 4) a confirmat indirect localizarea hepatică a transgenului. Majoritatea vectorilor administrați intraportal ai ambelor serotipuri testate au prezentat un tropism hepatic pronunțat. În special, vectorii pe bază de AAV5 au fost cei mai eficienți în transducerea majorității țesuturilor testate, inclusiv testicul, care ar putea fi o potențială preocupare pentru viitoarea aplicare clinică.

La momentul testării pentru GT (29 de săptămâni după injecție), grupul DIO cântărea în medie cu 14% mai mult decât grupul ND. Acest grad de obezitate, corespunzător parametrului indicelui de masă al corpului uman de ≈30, nu constituie o tulburare majoră, cum ar fi sindromul metabolic X, cu diabet însoțitor, hipertensiune arterială, dislipidemie și boli cardiovasculare. Este o afecțiune adesea caracterizată de o deficiență prediabetică GT, care poate evolua până la diabetul de tip 2 complet dezvoltat dacă nu este tratat. La testare, atât DIO cât și grupurile normale de animale au avut niveluri identice de glucoză în repaus alimentar (Fig. 2). Cu toate acestea, grupul DIO a demonstrat un răspuns slab la provocarea glucozei, un simptom clar al alterării GT. În mod remarcabil, ambele grupuri de șobolani tratați cu Acrp30 au prezentat un GT îmbunătățit, cu o curbă rAAV5-Acrp GT care nu se distinge de cea din grupul de control ND.

Datele noastre indică faptul că una dintre modalitățile terapeutice ale Acrp30 exprimat ectopic este mediată prin potențialul său anorexigenic. Ambele grupuri tratate cu rAAV1-Acrp30- și rAAV5-Acrp30 (Fig. 1) au prezentat o reducere a FI, ceea ce este semnificativ în ultima cohortă. Această observație contrazice constatările lui Fruebis și colab. (13), care au demonstrat că tratamentul cronic al șoarecilor DIO cu gAcrp30 a dus la reducerea BW independent de FI. În acest moment, nu putem explica discrepanța dintre cele două studii decât menționând presupunerea că gAcrp30 și un hormon de lungime completă au funcții fiziologice diferite (39) și organe țintă (38).

Recent, s-a arătat că Acrp30 (36, 37) activează proteina kinază activată cu AMP (AMPK), un „switch metabolic master” care controlează căile de ketogeneză hepatică, sinteza colesterolului și sinteza trigliceridelor (40). La activare, AMPK fosforilează numeroase proteine ​​țintă, rezultând un flux crescut sau scăzut prin căile metabolice în care proteinele țintă joacă un rol de reglare. Alternativ, o formă de AMPK exprimată în nucleul celular poate influența și metabolismul prin reglarea expresiei genice (41-43). În raportul actual, oferim dovezi că rAAV-Acrp30 modulează expresia a două gene hepatice cheie supuse reglementării AMPK, PEPCK și SREBP-1c.

Produsul genei PEPCK catalizează o etapă de limitare a ratei în gluconeogeneză, iar reglarea anormală a acestei gene a fost asociată cu dezvoltarea diabetului de tip 2 și a obezității (30, 44, 45). FIG. 5A arată o reducere marcată a ratelor de expresie a genei PEPCK la animalele tratate cu rAAV-Acrp30, mai pronunțată în cazul vectorului AAV5. Acest rezultat este în concordanță cu observația lui Combs și colab. (16), care au demonstrat că expresia hepatică a PEPCK și a glucozei-6-fosfatazei au fost reduse cu> 50% după perfuzia cu Acrp30.

O altă genă din aval modulată de cascada Acrp30/AMPK este SREBP-1c, un factor de transcripție stimulat de insulină care este implicat în patogeneza rezistenței la insulină, dislipidemie și diabet de tip 2 (34, 46). În ficat, trei SREBP, inclusiv izoforma 1-c, reglează expresia a> 30 de gene implicate în metabolismul lipidelor (32) și gluconeogeneza (47). Similar cu PEPCK, expresia SREBP-1c este semnificativ reglată în jos de rAAV-Acrp30 (Fig. 5B). Rezultatele noastre, prin urmare, sugerează că, la activarea receptorului AdipoR2, Acrp30 reglează două căi hepatice distincte, lipogeneza și gluconeogeneza, dicotomizându-se în aval în punctul comutatorului principal AMPK (Fig. 6). Sunt necesare studii suplimentare pentru a descoperi legăturile lipsă în aceste cascade de semnalizare inițiate de Acrp30.

Căi metabolice reglementate de Acrp30 în ficat. Reglarea în sus și în jos a reglării genelor și căilor metabolice sunt indicate de săgețile respective în sus și în jos. Săgețile bloc indică interacțiunile documentate în acest raport sau în altă parte (37).

Pe scurt, expresia ectopică a transgenului adipokinei Acrp30 în ficatul modelului de șobolan DIO oferă efecte benefice pe termen lung de reducere a greutății și de creștere a insulinei. Aceste efecte par a fi mediate prin diverse căi metabolice care includ reglarea FI, lipogeneza și gluconeogeneza. În așteptarea unor studii cuprinzătoare ulterioare ale mecanismelor și siguranței abordării descrise în terapia genică, descoperirile noastre prezintă o modalitate terapeutică alternativă în tratamentul obezității și a diabetului de tip 2.

Mulțumiri

Mulțumim Dr. Yuri Sautin pentru sfaturi tehnice cu privire la proiect. Acest studiu a fost susținut de Institutul Național de Sănătate Institutul Național pentru Diabet și Boli Digestive și Rinice Grant R01 DK62302 (către S.Z.) și de Serviciul de Cercetare Medicală al Departamentului Afacerilor Veteranilor.

Note de subsol

Cui ¶ Cui îi trebuie adresată corespondența la: P.O. Caseta 100266, Centrul de terapie genică Powell, Centrul de sănătate J. Hillis Miller, Universitatea din Florida, Gainesville, FL 32610-0266. E-mail: sergeiufl.edu .

Această lucrare a fost trimisă direct (pista II) la biroul PNAS.