A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Tomomi Masuya, Miyako Suzuki

genă

Investigarea rolurilor, scrierea - schiță originală

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Tomomi Masuya, Miyako Suzuki

Roluri Arhivarea datelor, Investigații, Scriere - schiță originală

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Investigarea rolurilor, resurse

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Investigarea rolurilor, resurse

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Divizia de afiliere a animalelor experimentale, Centrul pentru promovarea cercetării și educației medicale, Școala de absolvire a medicinei, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Roluri Metodologie, Resurse

Divizia de afiliere a animalelor experimentale, Centrul pentru promovarea cercetării și educației medicale, Școala de Medicină absolută, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Roluri Curarea datelor

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Roluri de supraveghere, scriere - recenzie și editare

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Roluri Achiziție finanțare, investigație, administrare de proiecte, validare, scriere - revizuire și editare

Laboratorul de afiliere pentru nutriția animalelor, Departamentul de științe animale, Școala postuniversitară de științe bioagricole, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

  • Tomomi Masuya,
  • Miyako Suzuki,
  • Junko Tsujimura,
  • Shinsaku Kanamori,
  • Yuki Miyasaka,
  • Tamio Ohno,
  • Atsushi Murai,
  • Fumihiko Horio,
  • Misato Kobayashi

Cifre

Abstract

Citare: Masuya T, Suzuki M, Tsujimura J, Kanamori S, Miyasaka Y, Ohno T și colab. (2020) Ablația Iah1, o genă candidată pentru ficatul gras indus de dietă, nu afectează acumularea de lipide hepatice la șoareci. PLoS ONE 15 (5): e0233087. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0233087

Editor: Hervé Guillou, INRA, FRANȚA

Primit: 19 martie 2020; Admis: 28 aprilie 2020; Publicat: 14 mai 2020

Disponibilitatea datelor: Datele despre microarray au fost depozitate în NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE14750).

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de un grant în ajutor pentru cercetare științifică (C) (nr. 25450166, 18K05532) de la Societatea japoneză pentru promovarea științelor (https://www.jsps.go.jp/), un grant de la Fundația Memorială Uehara (https://www.ueharazaidan.or.jp/), și o subvenție de la Japan Health Foundation (http://www.jnhf.or.jp/) (către MK). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Nicio altă parte a acestei lucrări, în afară de rezumat, nu a fost publicată anterior sau nu este în curs de examinare pentru publicare în altă parte. Niciunul dintre autori nu are de declarat vreun conflict de interese.

Introducere

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) se referă la o gamă largă de afecțiuni hepatice care apar fără consum excesiv de alcool, de la steatoză simplă la steatohepatită, fibroză și ciroză [1]. Incidența NAFLD a crescut la nivel mondial, împreună cu prevalența crescută a obezității, a diabetului de tip 2 și a dislipidemiei [2]. Steatoza hepatică este cauzată de aportul excesiv de energie și de lipsa exercițiilor fizice și apare atunci când echilibrul metabolismului lipidic în ficat este perturbat. Cu toate acestea, deoarece nu numai factorii de mediu, cum ar fi dieta și exercițiile fizice, ci și factorii genetici, afectează dezvoltarea NAFLD, patogeneza acestei boli nu a fost pe deplin înțeleasă.

În acest studiu, pentru a investiga relația dintre Iah1 și acumularea de lipide hepatice, am produs șoareci Iah1 knockout (KO) cu fundal C57BL/6N și A/J-12 SM. De asemenea, am efectuat analize de microarray de ADN folosind țesutul adipos epididimal al șoarecilor A/J-12 SM (WT_A12) și A/J-12 SM Iah1-KO (KO_A12) pentru a investiga efectul deficitului de Iah1 asupra metabolismului lipidic.

Materiale și metode

Animale

Toți șoarecii au fost menținuți la 23 ± 2 ° C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumina aprinsă de la 8:00 la 20:00) și acces ad libitum la alimente și apă în condiții convenționale, în facilitățile de la Școala Absolventă de Științe Bioagricole, Universitatea Nagoya. Șoarecii au fost înțărcați la vârsta de 3 săptămâni și au fost găzduiți cuști individuale la vârsta de 5 săptămâni.

Dieta și programul experimental

Șoarecii masculi Iah1-wild (WT_B6 sau WT_A12) și -KO (KO_B6 sau KO_A12) au fost hrăniți cu un chow standard, CE-2 (CLEA Japan, Inc., Japonia), până la vârsta de 6 săptămâni. Ulterior, toți șoarecii au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (D07053003; Research Diets, New Brunswick, NJ, SUA) cu vârsta cuprinsă între 6 și 18 săptămâni (timp de 12 săptămâni). Compoziția dietei bogate în grăsimi a fost descrisă anterior [7]. Pe scurt, dieta bogată în grăsimi utilizată include untură de porc (30% g/g) și cazeină (20,9% g/g). Greutatea corporală a fost măsurată în fiecare săptămână în timpul perioadei experimentale (6-18 săptămâni). La vârsta de 18 săptămâni, probele de sânge au fost colectate din venele orbitale după un post de 4 ore (9:00 - 13:00). Apoi, șoarecii au fost sacrificați prin dislocare cervicală. Țesuturile (ficat, rinichi, plămâni, țesut adipos maro, grăsime epididimală, grăsime subcutanată, grăsime mezenterică și grăsime retroperitoneală) au fost colectate, cântărite și congelate imediat folosind azot lichid.

Acest studiu a fost realizat în conformitate cu Regulamentul privind experimentele pe animale de la Universitatea Nagoya. Toate procedurile și îngrijirea animalelor au fost aprobate de Comitetul de experimentare a animalelor, Școala Absolventă de Științe Bioagricole, Universitatea Nagoya (aprobare nr. 201622604, 2017030219, 2018031316).

Analiza secvenței ADN

Gena Iah1 și genele candidate în afara țintei de șoareci KO_A12 au fost amplificate prin PCR și produsele PCR au fost purificate folosind kitul ExoSAP-IT (Affymetrix). Primerii utilizați pentru analiza secvenței efectelor în afara țintei sunt prezentați în tabelul S2. Produsele PCR purificate au fost marcate folosind trusa de secvențiere a ciclului BigDye Terminator v3.1 și ADN-ul marcat a fost purificat prin precipitare cu etanol. Precipitatul a fost apoi dizolvat în Hi-Di Formamidă (Applied Biosystems). Secvențele de ADN au fost determinate utilizând Analizorul genetic aplicat Biosystem 3130/3130xl (Applied Biosystems).

Analiza Western blot

Măsurarea concentrațiilor serice de lipide și glucoză

Concentrațiile plasmatice ale trigliceridelor (TG), colesterolului total (TC), colesterolului HDL (HDL-C), fosfolipidelor (PL) și ale acidului gras neesterificat (NEFA) au fost măsurate folosind trusa de testare a trigliceridelor E, trusa de testare a colesterolului E, Kitul de testare HDL-colesterol-E, kitul de testare fosfolipid-C și kitul de testare NEFA-C (respectiv toate kiturile de testare, care au fost obținute de la Wako Pure Chemical Industries, Japonia). Concentrațiile serice de glucoză au fost măsurate folosind kitul de testare Glucoză-CII (Wako Pure Chemical Industries).

Măsurarea lipidelor hepatice

Ficatul congelat (aproximativ 0,3 g fiecare) a fost omogenizat cu 25 ml de cloroform-metanol (2: 1) și extras static peste noapte. Extractele organice (200 μL) au fost uscate și dizolvate în izopropanol (200 μL). TG și TC total în izopropanol au fost măsurate folosind trusa de testare a trigliceridelor-E și, respectiv, trusa de testare a colesterolului-E. Extractul organic rămas a fost utilizat pentru măsurarea lipidelor hepatice totale așa cum a fost descris anterior de Folch și colab. [16].

QPCR în timp real

ARN-ul total din țesut a fost extras folosind reactivul TRI (Molecular Research Center Inc.). ARN-ul total a fost tratat cu trusa fără ADN TURBO (Thermo Fisher Scientific) pentru a elimina contaminarea ADN-ului. Apoi, ADNc a fost sintetizat folosind kitul de transcripție inversă de mare capacitate (Applied Biosystems). Am folosit un sistem StepOne Plus în timp real pentru PCR (Applied Biosystems) cu Thunderbird qPCR Mix sau Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Japonia) pentru a măsura nivelurile de expresie genică. Fiecare nivel de ARNm a fost normalizat la nivelul corespunzător de ARNm de β-actină. Genele TaqMan (teste de expresie genică TaqMan, Mm00509467_m1; Applied Biosystems) au fost utilizate pentru a determina nivelul de ARNm al Iah1. Primerii utilizați pentru testele SYBR Green sunt prezentate în tabelul S3.

Analiza microarray-ului ADN în grăsimea epididimală

ARN-ul total a fost extras din grăsimea epididimală a șoarecilor WT_A12 și KO_A12 hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni folosind reactivul TRI. Apoi, ARN-ul obținut a fost purificat folosind RNeasy Mini Kit (QIAGEN). ARN total de la trei șoareci pe tulpină a fost reunit pentru fiecare matrice. Transcrierile din grăsimile epididimale au fost măsurate folosind un Clariom S Mouse Array (Applied Biosystems). Datele brute au fost normalizate cu algoritmul STT-RMA folosind software-ul Applied Biosystems GeneChip Console ver.1.3.0. Datele despre microarray au fost depozitate în NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE14750).

analize statistice

Toate rezultatele au fost exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Testul t al studentului a fost folosit pentru a compara mediile dintre șoarecii WT (WT_B6 sau WT_A12) și KO (KO_B6 sau KO_A12). Diferențe cu fundal p SM și le-a analizat fenotipul.

(A) Lipide totale hepatice, (B) trigliceride și (C) concentrații totale de colesterol la șoareci WT_B6 și KO_B6 hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. WT_B6 (n = 8), KO_B6 (n = 8).

Șoareci Iah1 KO pe fundal A/J-12 SM

Am construit șoareci Iah1-KO pe un fundal A/J-12 SM (KO_A12) utilizând sistemul CRISPR/Cas9 pentru a investiga relația dintre Iah1 și dezvoltarea ficatului gras. Sistemul CRISPR/Cas9 a generat o ștergere de 53 bp care a dus la mutații de frame-shift care au dus la formarea unui codon de oprire prematur (Fig. 2A). Această mutație induce o descompunere mediată de prostii a transcrierii ARNm. Expresia ARNm Iah1 și proteinei IAH1 nu au fost detectate la șoarecii A/J-12 SM Iah1-KO (KO_A12) (Fig. 2B și 2C). În ceea ce privește site-urile de clivaj prevazute în afara țintei, nu au fost detectate mutații prin secvențiere.

(A) Secvența de ARNc (în cutie) care vizează nucleaza Cas9 către o regiune a exonului 1 din gena șoarecelui Iah1. A fost identificat mouse-ul cu o ștergere de 53bp și o mutație de framehift. (B) Analiza qPCR în timp real a nivelurilor de ARNm Iah1 la șoarecii WT_A12 și KO_A12. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. WT_A12 (n = 4), KO_A12 (n = 4). **, semnificativ diferit (p SM fundal (Tabelul 2). Mai mult, greutatea ficatului și a țesutului adipos alb de la șoarecii KO_A12 nu diferă de cele găsite la șoarecii WT_A12 (Tabelul 2). În mod similar, concentrațiile serice de lipide și glucoza serică concentrațiile la 12 săptămâni de hrănire (vârsta de 18 săptămâni) nu au diferit între șoarecii WT_A12 și KO_A12 (Tabelul 2). Ne-am așteptat ca nivelurile TG hepatice să crească la șoarecii KO_A12, dar am constatat că au rămas neschimbate între șoarecii KO_A12 și WT_A12 (Fig 3B De asemenea, nu au existat modificări semnificative ale conținutului total de lipide hepatice și TC hepatice între șoarecii WT_A12 și KO_A12 (Fig 3A și 3C). Astfel, aceste date indică faptul că deficiența Iah1 nu modifică greutatea corporală, lipidele serice și concentrațiile serice de glucoză și ficatul conținut de lipide.

(A) Lipide totale hepatice, (B) trigliceride și (C) concentrații totale de colesterol la șoareci WT_A12 și KO_A12 hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. WT_A12 (n = 16), KO_A12 (n = 11).

Deficitul de Iah1 nu afectează expresia genelor legate de metabolismul lipidelor în ficat și în grăsimea epididimală

Am analizat anterior nivelurile de ARNm ale genelor legate de metabolismul lipidic în celulele Hepa1-6 (linia celulară de hepatom de șoarece) care au supraexprimat Iah1 de șoarece. Am constatat că expresia mARN a diacilglicerol O-aciltransferazei 2 (Dgat2) și a antigenului Cd36 (Cd36) au fost suprimate în celulele Hepa1-6 care au supraexprimat șoarecele Iah1 [6]. În acest studiu, pe lângă aceste gene, am măsurat, de asemenea, nivelurile de ARNm ale genelor legate de metabolismul lipidic (Srebp1-c, Pparγ, Fasn și Mtp) în ficat și grăsimea epididimală a șoarecilor KO_A12. Rezultatele noastre au arătat că nivelurile de ARNm nu au fost semnificativ diferite între șoarecii WT_A12 și KO_A12 (Fig. 4A și 4B). Prin urmare, acest lucru sugerează că deficiența de Iah1 nu afectează expresia acestor gene legate de metabolismul lipidic în ficat și în grăsimea epididimală.

Nivelurile de ARNm au fost măsurate prin qPCR în timp real în ficat (A) și grăsime epididimală (B). Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. WT_A12 (n = 5-8), KO_A12 (n = 5-8). Srebp1-c, factorul de transcripție 1c al elementului de reglare a sterolului; Pparγ, receptor gamma activat de proliferatorul peroxizomului; Dgat2, diacilglicerol O-aciltransferaza 2; Fasn, acizi grași sintaza; CD36, antigen Cd36; Mtp, o proteină de transfer trigliceridic microsomal.

Analiza microarray de ADN a grăsimii epididimale la șoareci KO_A12

Nivelurile de ARNm ale genelor reglate în sus sau în jos au fost măsurate prin qPCR în timp real în grăsimi epididimale (A, B) și grăsimi retroperitoneale (C). Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. WT_A12 (n = 5-8), KO_A12 (n = 5-8). *, Semnificativ diferit (p Fig. 6. Nivelurile de ARNm ale genelor Sfrp4 din aval în grăsimea epididimală a șoarecilor WT_A12 și KO_A12 hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni.

Nivelurile de ARNm de Pparγ, β-catenină și C/EBPα în grăsimea epididimală au fost măsurate prin qPCR în timp real. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. WT_A12 (n = 5-8), KO_A12 (n = 5-8). Pparγ, receptor gamma activat de proliferatorul peroxizomului; C/EBPα, CCAAT/proteina alfa care leagă amplificatorul.

Discuţie

În acest studiu, ne-am concentrat asupra genei Iah1 ca cea mai probabilă genă candidată pentru Fl1sa și QTL pentru ficatul gras de pe cromozomul 12 identificat în șoarecele model de ficat gras indus de dietă bogată în grăsimi, șoarecele SMXA-5 [6]. Prin urmare, pentru a investiga relația dintre Iah1 și ficatul gras in vivo, am analizat fenotipul șoarecilor Iah1-KO stabilit pe două medii diferite (C57BL/6N și A/J-12 SM).

Șoarecii KO_B6 au fost sistemic deficienți în Iah1 mARN și proteine ​​IAH1, iar deficiența genei Iah1 nu a dus la moartea embrionară. Mai mult, nu am observat o acumulare semnificativ mai mare de TG la șoareci KO_B6 în comparație cu șoareci WT_B6, ambii fiind hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi timp de 12 săptămâni. Un studiu anterior a raportat că șoarecii C57BL/6J, care este unul dintre substrenele derivate din C57BL/6, sunt mai predispuși să dezvolte obezitate severă și diabet de tip 2 decât șoarecii A/J hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi [21]. Prin urmare, am crezut că efectul deficitului de Iah1 asupra dezvoltării ficatului gras ar putea fi mascat în fundalul C57BL/6N. Ca atare, am creat șoareci Iah1-KO pe un fundal A/J-12 SM folosind sistemul CRISPR/Cas9. Am raportat anterior că acumularea de TG hepatică la șoarecii SM A/J-12 care aveau alela SM/J pe Fl1sa a fost suprimată în comparație cu șoarecii A/J [5]. Ne-am așteptat ca deficiența de Iah1 pe un fond A/J-12 SM să inducă în mod semnificativ dezvoltarea ficatului gras. Cu toate acestea, acumularea de TG hepatică la șoarecii KO_A12 nu a diferit de cea a șoarecilor WT_A12 (A/J-12 SM) (Fig. 3). În total, datele menționate mai sus au demonstrat că Iah1 nu este o genă responsabilă de Fl1sa.

Deoarece Iah1 nu este o genă responsabilă de Fl1sa, luăm în considerare o altă genă candidată, și anume, Lpin1 (care codifică proteina Lipin1) care este situată la 16,7 Mb pe cromozomul de șoarece 12. Lipin1 a fost identificată ca o genă mutantă în distrofia ficatului gras (fld) mouse [26]. S-a demonstrat că gena mutantă lipin1 afectează dezvoltarea țesutului adipos, ceea ce a dus la dezvoltarea ficatului gras. Phan și Reue au raportat că modularea nivelurilor de exprimare a lipinei 1 duce la modificări dramatice ale adipozității [27]. Prin urmare, este necesar să se analizeze alte gene candidate pentru Fl1sa, inclusiv Lipin1, pentru a elucida mecanismul de dezvoltare a ficatului gras la șoareci SMXA-5.

Concluzii

În acest studiu, pentru a clarifica relația dintre gena Iah1 (cea mai probabilă genă candidată pentru Fl1sa) și ficatul gras in vivo, am construit șoareci Iah1-KO pe două medii genetice diferite (C57BL/6N și A/J-12 SM). Datele de la ambele tipuri de șoareci Iah1-KO (KO_B6 și KO_A12) au demonstrat că absența genei Iah1 nu a afectat acumularea de lipide în ficat. Concluzionăm că gena Iah1 nu este o genă responsabilă de Fl1sa.

Informatii justificative

S1 FIG. Generație de șoareci C57BL/6 Iah1 knockout (KO_B6).

(A) Schema generării șoarecilor KO_B6 utilizând sistemul Cre-loxP. Figura modificată din Skarnes și colab. [11] și EUCOMM (http://www.mousephenotype.org/about-ikmc/eucomm). Șoarecii tm1a (fondul genetic C57BL/6NTac) au o alelă heterozigotă, eliminată mai întâi cu siturile loxP și siturile Frt. Șoarecii transgenici CAG-Cre (fundal genetic C57BL/6NCrSlc) prezintă expresia constitutivă a genei Cre recombinazei sub controlul promotorului CAG. Șoarecii tm1b au construcția genomului lui Iah1 care a eliminat exonul 3 și 4. (B) Schema de reproducere a șoarecilor KO_B6.

S2 FIG. Niveluri de expresie ale ARNm Iah1 și proteinei IAH1 la șoareci KO_B6.

(A) Analiza qPCR în timp real a nivelurilor de ARNm Iah1 la șoarecii WT_B6 și KO_B6. Datele au fost exprimate ca medie ± SEM. (n = 4-7, ** p 0,45) și secvențele primerilor utilizați pentru analiza secvenței.