Colegiul de medicină veterinară de afiliere, Universitatea Konkuk, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seul, Coreea de Sud

semințe

Afiliere USDA, ARS, Albany, California, Statele Unite ale Americii

Afiliere USDA, ARS, Albany, California, Statele Unite ale Americii

Colegiul de Medicină Veterinară de Afiliere, Universitatea Konkuk, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seul, Coreea de Sud

Colegiul de medicină veterinară de afiliere, Universitatea Konkuk, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seul, Coreea de Sud

Colegiul de medicină veterinară de afiliere, Universitatea Konkuk, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seul, Coreea de Sud

Departamentul de Afiliere pentru Alimentație și Nutriție, Universitatea Hanyang, Wangsimni-ro, Seongdong-gu, Seul, Coreea de Sud

Afiliere USDA, ARS, Albany, California, Statele Unite ale Americii

  • Kun-Ho Seo,
  • Glenn E. Bartley,
  • Christina Tam,
  • Hong-Seok Kim,
  • Dong-Hyeon Kim,
  • Jung-Whan Chon,
  • Hyunsook Kim,
  • Wallace Yokoyama

Cifre

Abstract

Citare: Seo K-H, Bartley GE, Tam C, Kim H-S, Kim D-H, Chon J-W și colab. (2016) Făina de semințe de struguri Chardonnay ameliorează steatoza hepatică și rezistența la insulină prin expresia modificată a genei hepatice pentru stresul oxidativ, inflamația și sinteza lipidelor și ceramidelor la șoarecii obezi induși în dietă. PLoS ONE 11 (12): e0167680. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167680

Editor: Carlos M. Rodriguez-Ortigosa, Universitatea din Navarra, SPANIA

Primit: 8 aprilie 2015; Admis: 18 noiembrie 2016; Publicat: 15 decembrie 2016

Acesta este un articol cu ​​acces liber, fără drepturi de autor și poate fi reprodus, distribuit, transmis, modificat, construit sau utilizat în orice mod de către oricine în orice scop legal. Lucrarea este pusă la dispoziție sub dedicarea domeniului public Creative Commons CC0.

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierul său de informații justificative.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvenția Fundației Naționale de Cercetare din Coreea (NRF) finanțată de guvernul Coreei (MSIP) (Nr. 2015R1A2A2A01005017) și parțial de un grant al Institutului Național de Alimentație și Agricultură (NIFA) pentru faza I a Programului de cercetare pentru inovare în întreprinderi mici ( NIFA/SBIR 2013-00549).

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Boala ficatului gras nealcoolic (NAFLD) este recunoscută ca o problemă semnificativă de sănătate publică. Prevalența NAFLD este de 20-30% din populația generală a țărilor occidentale [1]. NAFLD variază de la steatoză (ficat gras simplu) la steatohepatită nealcoolică (NASH), o afecțiune care crește morbiditatea și mortalitatea legată de ficat. Acumularea excesivă de lipide hepatice, stresul oxidativ și al reticulului endoplasmatic (ER), inflamația și rezistența la insulină sunt manifestările majore ale progresiei acestei boli. Deși etiologia NAFLD nu este pe deplin înțeleasă, „ipoteza cu două lovituri” este larg acceptată [2]. În această ipoteză, acumularea excesivă de lipide hepatice este urmată de stres oxidativ crescut și inflamație, rezultând leziuni hepatice.

Majoritatea studiilor privind efectele benefice ale semințelor de struguri asupra NAFLD au fost realizate folosind extracte polifenolice apoase sau alcoolice din semințe de struguri [14-17]. Recent, accentul pus pe beneficiile flavonoide pentru sănătate din produsele din struguri sa extins la semințele de struguri de vin, un produs secundar al procesului de vinificare. Semințele de struguri întregi pot conține cantități semnificative de compuși fenolici inextractabili care contribuie la activitatea lor biologică. Semințele de struguri conțin două treimi din flavonoidele extractibile ale strugurilor și au cele mai mari concentrații din cele mai comune flavonoide, flavan-3-olii (flavanoli). Flavanolii includ catehină, epicatechină, 3-O-galatele lor și dimeri (epi) catehină, oligomeri și polimeri. Catehina monomerică (epi) este ușor absorbită de intestinul subțire. Oligomerii și polimerii nu sunt absorbiți, dar sunt absorbiți metaboliții lor de acid fenolic produși de bacteriile intestinale.

Materiale și metode

Animale și diete

Colectare cu plasmă și ficat

Șoarecii au fost lipsiți de hrană timp de 12 ore și au fost anesteziați cu un vaporizator (VetEquip, Livermore, CA) cu 4% izofluran (Phoenix Pharmaceutical, St. Joseph, MO, SUA) și 1L/min debit de oxigen într-o cameră de inducție. Animalele culcate au fost menținute la 2-4% izofluran prin noseconă, iar sângele a fost colectat prin puncție cardiacă cu seringi clătite anterior cu soluție EDTA de potasiu (15% g/v). Ficatele și țesuturile adipose epididimale au fost ulterior colectate, cântărite și congelate imediat în azot lichid pentru o analiză ulterioară. Plasma a fost separată după centrifugare la 2.000 × g timp de 30 de minute la 4 ° C.

Conținut lipidic total hepatic

După uscare prin congelare, ficatul praf a fost cântărit și amestecat cu 2 ml CHCI3/MeOH (2: 1), sonicat timp de 5 minute și incubat peste noapte. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 1000 rpm și supernatantele au fost îndepărtate. S-au adăugat încă 2 ml CHCI3/MeOH înainte de sonicare și au stat peste noapte pentru extracție. Solventul a fost îndepărtat din extractele combinate sub azot și conținutul total de lipide hepatice totale a fost determinat gravimetric.

Conținut extras de flavonoizi

O probă de 0,2 g a fost extrasă cu 20 ml de metanol timp de 30 de minute cu agitare, urmată de sonicare și centrifugare. Supernatanții au fost supuși cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC) și analizei fenolice totale. Fenoli totali și compuși flavonoizi au fost analizați folosind metodele Folin-Ciocalteu și respectiv HPLC standard, așa cum s-a descris anterior [20].

Analiza lipidelor plasmatice

Colesterolul lipoproteic plasmatic a fost determinat prin cromatografie de excludere a dimensiunii, așa cum s-a descris anterior [21]. HPLC a fost efectuată utilizând un cromatograf HPLC Agilent 1100 cu o coloană Superose 6HR HPLC (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ, SUA) constând dintr-o bobină de amestecare (1615–50 Bodman, Aston, PA, SUA) într-o apă cu temperatură controlată sacou (Aura Industrials, Staten, NY, SUA). O pompă HPLC Hewlett-Packard (79851-A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, SUA) a fost utilizată pentru a livra reactiv de colesterol (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, SUA) la un debit de 0,2 ml/min. Standardele de lipoproteine ​​ale colesterolului bovin au fost folosite pentru calibrarea semnalelor pe baza zonelor de vârf.

Testul de toleranță la insulină și testul de toleranță la glucoză

Pentru testul de toleranță la insulină (ITT), după un post de 3 ore, șoarecilor li s-a administrat insulină pe cale intraperitoneală (0,5 U/kg greutate corporală), iar nivelurile de glicemie din vena cozii au fost determinate la 0, 30 și 60 de minute după injectarea insulinei cu ajutorul unui OneTouch Ultrameter (LifeScan Inc. Wayne, PA, SUA). Testul de toleranță la glucoză (GTT) a fost efectuat după administrarea intraperitoneală de glucoză (2 g/kg greutate corporală). Concentrația de glucoză din sânge a fost determinată cu prelevări de sânge din vena cozii la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute după injectarea glucozei folosind un ultrametru OneTouch (LifeScan, Inc.).

Expresia genelor și analiza microarrayului Exon

PCR în timp real

ARN-ul total din ficat a fost extras folosind trusa de purificare a ARN-ului TRIzolplus (Invitrogen, Life Technologies), iar cADN-ul a fost sintetizat utilizând un kit GeneAmpRNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) conform protocolului producătorului. Un microlitru de ADNc diluat (1:10) a fost utilizat în fiecare timp real (RT) -PCR folosind SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA) cu un instrument Mx3000P (Stratagene, Cedar Creek, TX, SUA ). Condițiile ciclului au fost după cum urmează: 5 min la 95 ° C urmate de 40 de cicluri la 94 ° C timp de 15 s, 55-60 ° C timp de 1 min și 72 ° C timp de 30 s. Secvențele de primeri sunt prezentate în Tabelul 2 și în [22,23] și în alte studii anterioare [24]. Grundurile au fost validate de mărimile produselor PCR. Nu s-a observat nicio acumulare de produse nespecifice sau dimeri de grund prin electroforeza pe gel a produselor PCR. Rezultatele au fost analizate folosind software-ul furnizat împreună cu sistemul Stratagene Mx3000P QPCR. Diferențele în expresia ARNm au fost calculate după normalizarea la expresia ARNm 36B4 folosind metoda ΔΔCT.

Nivelul ROS hepatic

Nivelul ROS în ficat a fost determinat folosind sonda de fluorescență diclorofluoresceină (DCF) așa cum s-a descris anterior [25]. Soluția stoc de diacetat de 2 ', 7'-diclorofluorescină (DCFDA, D6883, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a fost preparată prin dizolvarea DCFDA în 12,5 mM etanol și stocată la -80 ° C până la utilizare. Aproximativ 20 mg de ficat s-au omogenizat în 0,5 ml soluție salină tamponată HEPES (140 mM NaCI, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucoză), centrifugată la 1000 × g timp de 10 min. Omogenatul care conține 100 μg de proteine ​​a fost pipetat într-o placă neagră cu 96 de godeuri. DCFDA a fost diluat la 125 μM imediat înainte de utilizare și pipetat în fiecare godeu până la o concentrație finală de 25 μM. Placa a fost plasată pe un agitator timp de 2 minute și incubată la 37 ° C în întuneric timp de 30 de minute. Fluorescența a fost citită pe un contor Wallac Victor 3 Multilabel (PerkinElmer Inc., Waltham, MA) la excitație 485 nm/emisie 530 nm la 0 și 50 min. Nivelul ROS a fost exprimat ca valoarea crescută a absorbanței între 0 și 50 min. Intensitatea medie a fluorescenței a fost calculată de la cinci șoareci per grup.

Analiza Western Blot

Analize statistice

Toate datele sunt exprimate ca medie ± SE. Analiza varianței a fost efectuată utilizând programul statistic JMP7 (Institutul SAS, Cary, NC, SUA) pentru a examina efectele tratamentului asupra nivelului lipidelor plasmatice, greutății corpului și țesuturilor, aportul total de energie și raportul eficienței alimentării. Semnificația a fost definită la Tabelul 3. Greutatea corpului și a țesutului adipos și aportul de energie la șoarecii DIO hrăniți cu MCC și ChrSd timp de 5 săptămâni 1 .

Datele sunt exprimate ca medie ± SE; n = 8-10/grup. * P Fig 2. Efectul făinii de semințe de struguri Chardonnay (ChrSd) asupra (A) lipidelor plasmatice și (B) concentrației de leptină.

Șoarecii obezi induse de dietă masculină (DIO) au fost hrăniți cu diete bogate în grăsimi (HF) conținând 5% celuloză microcristalină (MCC, martor) sau 10% (g/g) ChrSd timp de 5 săptămâni, iar sângele a fost colectat într-un aliment lipsit de alimente stat. VLDL, o lipoproteină cu densitate foarte mică; LDL, lipoproteine ​​cu densitate mică; HDL, lipoproteine ​​de înaltă densitate. Datele sunt exprimate ca medie ± SE; n = 8-10/grup. * P Fig 3. Toleranță la insulină la șoarecii obezi hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HF) suplimentată fie cu 5% celuloză microcristalină (MCC, martor), fie cu 10% (g/g) făină de semințe de struguri Chardonnay (ChrSd) timp de 5 săptămâni.

(A) Testele de toleranță la insulină (ITT) au fost efectuate în starea de post. (B) Zona sub valorile curbei (ASC). Datele sunt exprimate ca medie ± SE. n = 8-9/grup. * P Tabelul 4. Rezumatul genelor selectate care prezintă o modulație hepatică semnificativă ≥ | 1,5 | de două ori la șoarecii hrăniți cu o dietă HF suplimentată cu ChrSd.

Pentru a confirma observațiile microarray, 13 gene asociate cu metabolismul colesterolului, β-oxidarea acizilor grași, homeostazia glucozei, sistemul imunitar, stresul oxidativ și metabolismul trigliceridelor au fost alese pentru verificare prin RT-PCR. Toate genele au prezentat modele de expresie comparabile cu datele microarray (Tabelul 5). Pentru a valida rezultatele microarray-ului la nivelul proteinei, am determinat expresia Chi3l1, Sptlc3 și Aldh1a1, observând reduceri de 3,1 ori pentru Chi3l1, 1,6 ori pentru Sptlc3 și 2,7 ori pentru Aldh1a1 la șoarecii DIO hrăniți cu ChrSd comparativ cu șoarecii pe dieta de control (Fig. 4A și 4B). O reducere consistentă a fost observată pentru toate proteinele în comparație cu datele microarray (Fig. 4). Intensitatea fluorescenței DCF, indicator de nivel intracelular ROS, în ficatul șoarecilor DIO hrăniți cu ChrSd a scăzut semnificativ cu 35% comparativ cu ficatul șoarecilor DIO hrăniți cu dieta de control (Fig 4C).

(A) Western blots de Chi3l1, Sptlc3 și Aldh1a1 în extracte de proteine ​​din ficatul șoarecilor obezi masculi, induși de dietă (DIO), hrăniți cu diete bogate în grăsimi (HF) care conțin 5% celuloză microcristalină (MCC, martor) sau 10% ( w/w) ChrSd timp de 5 săptămâni. (B) Cuantificarea expresiei proteinelor în (A). (C) Intensitatea fluorescenței DCF în ficatul șoarecilor masculi DIO hrăniți cu diete HF conținând 5% MCC sau 10% ChrSd timp de 5 săptămâni. Datele sunt exprimate ca medie ± SE; n = 3/grup. * P | 2.0 | în prezența suplimentării cu ChrSd (datele nu sunt prezentate). Este necesară o analiză suplimentară utilizând RT-PCR pentru a confirma îmbinarea alternativă a acestor gene.

Discuţie

Suplimentarea extractului de semințe de struguri bogat în catehină exprimă în mod regulat expresia genelor legate de oxidarea acizilor grași la ficatul șoarecelui [8]. Am constatat, de asemenea, că o dietă ChrSd bogată în catehină a reglat genele legate de sinteza acizilor grași (Scd1, Acot11, Mogat1) în timp ce a reglat genele legate de β-oxidarea acidului gras (Acsl3) în comparație cu o dietă de control. Drept urmare, dieta ChrSd a redus conținutul de lipide hepatice, contribuind la potențialul efect benefic asupra steatozei hepatice. Observăm că studiul nostru nu a determinat activitățile enzimelor implicate în oxidarea și sinteza acizilor grași. Modificările ARNm nu măsoară întotdeauna fluxul căii; cu toate acestea, studiile anterioare au arătat o relație liniară între activitatea de oxidare/sinteză a acidului gras și expresia genelor legate de căile metabolice ale acizilor grași. De exemplu, catechinele de ceai reglează în sus atât activitatea ARNm Acox1, cât și activitatea acizilor grași în ficat [44].

Mai multe studii au sugerat că stresul oxidativ este important în dezvoltarea complicațiilor legate de obezitate, cum ar fi rezistența la insulină și diabetul de tip 2 [38]. Consumul de extract de struguri roșii a îmbunătățit stresul indus de fructoză și sensibilitatea la insulină la rudele de gradul I sănătoase și supraponderale ale pacienților cu diabet de tip 2 [13]. Studiul nostru a arătat că suplimentarea cu ChrSd bogat în flavonoizi a redus semnificativ expresia genei Gdf15 sensibile la stres hepatic și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină, după cum se arată printr-o reducere cu 26% a ASC în timpul ITT de 2 ore comparativ cu martorul. Suplimentarea cu ChrSd a scăzut în mod semnificativ concentrația de glucoză în post și ASC în timpul unei GTT de 2 ore (ASC de control, 55.113 ± 2431; ASC ChrSd, 44.735 ± 2509, P Fig 5. Mecanisme propuse prin care făina de semințe de struguri Chardonnay bogată în flavonoizi ameliorează rezistență la insulină indusă de dietă bogată în grăsimi (HF), steatoză hepatică și boală hepatică grasă nealcoolică (NAFLD).

Suplimentarea cu ChrSd scade rezistența la insulină și steatoza hepatică indusă de HF și îmbunătățește sensibilitatea la leptină, urmată de scăderea stresului oxidativ și a inflamației prin reducerea sintezei ROS și a ceramidei. Rezultatul este o posibilă ameliorare a progresiei NAFLD indusă de IC. ROS, specii reactive de oxigen.

informatii justificative

S1 Tabel. Top 10 funcții biologice și primele cinci căi canonice și de rețea ale genelor modulate semnificativ de ChrSd.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de subvenția Fundației Naționale de Cercetare din Coreea (NRF) finanțată de guvernul Coreei (MSIP) (Nr. 2015R1A2A2A01005017) și parțial de un grant al Institutului Național de Alimentație și Agricultură (NIFA) pentru faza I a Programului de cercetare pentru inovare în întreprinderi mici ( NIFA/SBIR 2013–00549). Multe mulțumiri Sonomaceuticals, LLC/WholeVine Products și companiei lor surori pentru contribuția florilor de semințe de struguri și a analizei compoziționale și dnei. Christina Tam pentru asistența tehnică excelentă cu western blots.

Contribuțiile autorului

  1. Conceptualizare: KHS HK WY.
  2. Arhivarea datelor: GEB CT HK WY.
  3. Analiza formală: GEB CT HSK DHK JWC HK WY.
  4. Achiziție de finanțare: HK WY.
  5. Investigație: KHS HK WY.
  6. Metodologie: GEB CT HK WY HSK DHK JWC HK WY.
  7. Administrarea proiectului: KHS HK WY.
  8. Resurse: HK WY.
  9. Supraveghere: HK WY.
  10. Scriere - schiță originală: HK.
  11. Scriere - recenzie și editare: KHS HSK DHK JWC HK WY.