Imunitatea împotriva cancerului și imunoterapia

Editat de
Rayne Rouce

Baylor College of Medicine, Statele Unite

Revizuite de
Robin Parihar

Baylor College of Medicine, Statele Unite

Yang Xu

Universitatea de Știință și Tehnologie din Sud, China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

poly

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laborator cheie de stat al oncogenelor și genelor conexe, Shanghai Cancer Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai, China
  • 2 CARsgen Therapeutics, Shanghai, China

Introducere

S-a demonstrat că imunoterapia cu celule T adoptive este o nouă modalitate de combatere a tumorilor maligne. În special, limfocitele T proiectate pentru a exprima receptorul antigenului himeric (CAR) au demonstrat o mare promisiune în tratarea malignităților hematologice (1). Celulele CAR-T direcționate către CD19 au fost aprobate de FDA pentru a trata leucemia limfoblastică acută cu celule B recidivate (B-ALL) și limfomul difuz cu celule B mari (DLBCL) (2, 3).

Terapia CAR-T este, de asemenea, o abordare nouă pentru tratarea altor tumori maligne. În prezent, Glypian-3 (GPC3), receptorul factorului de creștere epidermică (EGFR), receptorul factorului de creștere epidermică uman (receptorul HER2), antigenul carcinoembrionar (CEA), disialogangliosida 2 (GD2), mezotelina, antigenul membranei specifice prostatei (PSMA) și interleukina-13Ra2 (IL13Ra2) au fost testate ca ținte ale celulelor CAR-T în tumoarea solidă. Cu toate acestea, terapia CAR-T pentru tumorile solide nu a fost la fel de eficientă ca cele care vizează malignități hematologice (4-7).

Motivele succesului limitat al celulelor T CAR în tumoarea solidă sunt investigate în mod activ și sunt probabil multifactoriale. Un motiv major este micromediul imunosupresor care poate împiedica funcția și persistența celulelor T CAR. Aceasta include prezența celulelor T reglatoare, a macrofagelor asociate tumorii, a celulelor supresoare derivate din mieloide (MDSC) și a fibroblastelor asociate cancerului, care promovează niveluri mai ridicate de liganzi inhibitori și citokine (8). Mai mult, numeroase molecule de control imun, cum ar fi PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, B7S1 (9), promovează epuizarea celulelor T și diminuează activarea celulelor T în țesuturi. În consecință, blocarea moleculelor punctului de control imun a îmbunătățit activitatea antitumorală a celulelor CAR-T (10). În plus, Indoleamina 2,3-dioxigenaza (IDO) este o enzimă intracelulară care mediază metabolismul aminoacidului esențial triptofan în metaboliți imunosupresori. Activitatea IDO tumorală poate inhiba terapia CAR-T prin acțiunea metaboliților triptofan, în timp ce inhibitorul IDO a restabilit controlul tumorii într-un model de limfom xenogrefă (11). Aceste date au sugerat că vizarea mediului imunosupresor al tumorii este o abordare potențială pentru creșterea imunității antitumorale a celulelor CAR-T.

Acidul polinozinic-policididilic (poli I: C), un analog sintetic al ARN-ului cu catenă dublă (dsRNA), este recunoscut de receptorul cu taxă 3 (TLR3), proteina kinază activată dsRNA (PKR), gena inductibilă a acidului retinoic I proteină (RIG-I) și proteina asociată diferențierii melanomului 5 (MDA5) (12). Aplicarea poli I: C în imunoterapia tumorală a fost bine investigată de câteva decenii. Poli I: C activează sistemul imunitar înnăscut, cu reglarea ulterioară a imunității adaptive (13), ducând la modificări ale microambientului tumoral și o supresie izbitoare a creșterii tumorii (14, 15). În plus, poli I: C a fost raportat că este capabil să prelungească supraviețuirea celulelor T CD4 + (16), să promoveze proliferarea celulelor T activate (17) și să reactiveze celulele T CD8 + care se infiltrează în tumoră (18). Mai mult, studiile au arătat că poli I: C ar putea declanșa direct celulele canceroase pentru a iniția apoptoza, astfel încât poli I: C ar putea reduce metastazele tumorale la șoarecii imunodeficienți (19). Acest lucru a construit rațiunea de a combina poli I: C cu terapia cu celule CAR-T.

În acest studiu, explorăm potențialul utilizării poli I: C pentru a crește activitățile antitumorale ale celulelor CAR-T și mecanismul de bază.

Materiale și metode

Linii celulare și medii

Linia de carcinom de colon murin CT26 (EGFRvIII NEG) a fost menținută în laboratorul nostru. Linia de celule renale embrionare umane 293T a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Ambele celule au fost crescute ca monostrat în mediu de cultură DMEM (Gibco) conținând 10% ser fetal bovin (FBS, Biowest) și 1% L-glutamină. Linia celulară de cancer mamar murin E0771 (EGFRvIII NEG, înzestrată de Dr. Xiang Zhang de la Baylor College of Medicine) a fost cultivată în mediu RPMI 1.640 (Gibco) suplimentat cu 10% FBS și 10 mmol/L HEPES. Toate celulele au fost menținute în mod obișnuit la 37 ° C într-un incubator cu atmosferă de 5% CO2. Aceste linii celulare au fost testate în mod regulat pentru micoplasmă și au fost negative.

Murine EGFRvIII Construction

Un omolog murin al mutației EGFRvIII uman a fost creat prin utilizarea secvențelor de ADNc care se întind pe EGFR murin conform raportului (20). Pe scurt, secvențele de ADNc donate în vectorul pPWT pentru a construi EGFRvIII murin recombinant au fost după cum urmează: perechi de baze 60-147, GT și 951-3737. Această procedură de clonare creează o peptidă joncțională (LEEKKGNYVVTDH) identică cu cea găsită în EGFRvIII uman. Vectorii lentivirali deficienți în replicare care conțin EGFRvIII murin recombinant au fost apoi generați de 293T de linii celulare de ambalare și utilizați pentru transfectarea celulelor CT26 și E0771. Celulele transfectate au fost incubate cu ch806 Ab urmate de FITC etichetate anti-IgG umane de capră, apoi celulele pozitive au fost sortate prin citometru de flux.

Analiza proliferării

Celulele tumorale au fost placate la 10 4 celule/godeu în plăci cu 96 de godeuri cu concentrații diferite de poli I: C (0,5 ng/mL, 5 ng/mL, 50 ng/mL, 500 ng/mL, 5 μg/mL). Celulele T activate au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri cu concentrații poli I: C de 10 și 50 μg/ml. Proliferarea celulară a fost analizată prin metoda CCK8 la 24, 48 și respectiv 72 ore.

Proiectarea CAR și generarea de celule CAR-T

Retrovirusul CAR specific pentru EGFRvIII murin recombinant a fost generat după cum urmează. 806 scFv (21) a fost inserat în tandem cu mCD8 trans-membrană, mCD28 și mCD3 regions regiuni intracelulare în vectorul retroviral MSCV. Supernatantul retroviral a fost generat prin cotransfecția tranzitorie a celulelor HEK 293T prin reactiv de transfecție PEI, împreună cu plasmida de ajutor pCL-Eco (dăruită de prof. Yongzong Liu de la Shanghai Cancer Institute). Patruzeci și opt de ore mai târziu, supernatantul a fost colectat și utilizat pentru transducerea limfocitului T splenic murin. Pe scurt, splenocitele șoarecilor au fost colectate de la șoareci sănătoși Balb/c sau C57, dezagregate și trecute printr-un filtru cu plasă de 70 μm. După liza celulelor roșii din sânge, limfocitele CD3 + T au fost izolate cu un kit de izolare cu celule T EasySep ™ Mouse (Stemcell). Celulele T purificate au fost activate cu dinabeaduri acoperite cu anti-CD3 și anti-C28 Ab (Gibco) timp de 24 de ore și transduse retroviral. Apoi celulele au fost cultivate în mediu RPMI 1.640 suplimentat cu 10% FBS (Gibco), 100 UI/mL rhIL2, 1 ng/mL rmIL-7 și 50 μmol/L β-mercaptoetanol timp de 3-5 zile și ulterior utilizate pentru experiment.

Analiza citometrică de flux

Transducția celulelor T a fost măsurată folosind proteina EGFRvIII marcată cu EGFP/Biotină generată în laboratorul nostru, urmată de PE-streptavidină când a fost nevoie. Fenotipurile de celule T au fost identificate folosind următorii anticorpi: șoarece CD3e (clona 145-2C11, Affymetrix eBioscience) conjugată cu FITC și șoarece CD8α (clona 53-6.7, Affymetrix eBioscience) conjugat cu PE.

Pentru a detecta MDSC din sânge, splină și tumori ale șoarecilor, șoarecii purtători de tumori au fost eutanasiați la 24 de ore după ultimul tratament poli I: C. Cincizeci de microlitri de sânge periferic extras din vena obrazului au fost incubați cu anticorpi împotriva CD11b de șoarece (clona M1/​​70, Biolegend) și Gr1 (clona RB6-805, BD bioscience), urmată de îndepărtarea globulelor roșii și apoi analizată prin citometrie în flux . Suspensiile cu celule unice ale splinei au fost obținute prin întreruperea mecanică printr-o sită celulară de 70 μm cu un piston, iar celulele roșii au fost apoi îndepărtate. Suspensiile de celule tumorale au fost obținute prin digestia țesuturilor tumorale disecate cu trusa de disociere a țesutului (Miltenyi). Toți anticorpii au fost utilizați în conformitate cu recomandările producătorului. Celulele vii au fost închise prin împrăștiere înainte/împrăștiere laterală (FSC/SSC). Analiza a fost efectuată folosind citometrul de flux FACSCelesta (BD Biosciences) și software-ul FlowJo (TreeStar).

In vitro Test de citotoxicitate

Activitatea celulelor CAR-T de a ucide celulele țintă in vitro a fost evaluat utilizând testul de eliberare a lactatului dehidrogenazei (LDH) (CytoTox 96 ® Test de citotoxicitate nonradioactivă, Promega). Celulele țintă au fost incubate cu celule T efectoare transduse CAR la diferite rapoarte efector-țintă (E: T). După 18 ore de co-incubare la 37 ° C, supernatantul a fost transferat pe o microplacă nouă și LDH eliberat în supernatant a fost evaluat folosind un cititor de microplăci. Citoliza specifică a fost calculată utilizând formula: (Test - control efector - control țintă/control Tmax - control țintă) × 100, în care „control Tmax” a fost valoarea obținută de la supernatantul celulelor țintă expuse la 1% Triton-X 100, „Controlul efectorului” a fost valoarea de eliberare spontană a LDH a CAR-T singur și „controlul țintei” a fost valoarea de eliberare spontană a LDH a celulelor țintă singure; controlul de fond (valoarea obținută doar din mediu) a fost scăzut din fiecare valoare înainte de calcul.

Test de eliberare a citokinelor

Celulele CAR-T murine au fost testate pentru activitatea specifică antigenului în testul de eliberare a citokinelor utilizând celule tumorale. În aceste experimente, celulele efectoare au fost co-cultivate cu un număr egal de celule țintă în mediu RPMI 1.640 complet într-un volum final de 0,2 ml în godeuri triplicate ale unei microplăci cu 96 de godeuri. Supernatantele de cultură au fost recoltate la 24 de ore după inițierea co-culturii și testate pentru IL-2 și IFN y de către ELISA (Multisciences). Nivelul seric de IFN γ al șoarecilor tratați cu tumori a fost detectat de ELISA (Multisciences).

In vivo Efect antitumoral al celulelor combinate poli I: C și CAR-T

Toate procedurile la animale au fost aprobate de Comitetul pentru Utilizarea și Îngrijirea Animalelor din Shanghai Cancer Institute și efectuate în conformitate cu protocolul. Pentru inducerea tumorii, șoarecii de sex feminin Balb/c în vârstă de 6-7 săptămâni au fost iradiați cu iradiere a întregului corp de 3 Gy și apoi s-au injectat 3 × 105 celule C26-EGFRvIII suspendate în 200 μl PBS s.c. în flancul șoarecilor. Pentru a stabili tumori de sân ortotopice, am injectat 5 × 10 5 celule E0771-EGFRvIII în al 4-lea tampon de grăsime mamară inghinală de șoareci femele C57BL/6 în vârstă de 6-7 săptămâni. Șoarecii purtători de tumori au fost tratați cu 5 × 106 celule CAR-T prin injectare de venă coadă. Șoarecii din grupurile martor au fost injectați cu aceeași cantitate de celule T netransduse (UT). Cincizeci de micrograme poli I: C cu greutate moleculară mare (pIC, InvivoGen) au fost injectate intratumoral la 3 și 6 zile după perfuzia CAR-T. Șoarecii injectați intratumoral cu același volum de soluție salină au fost folosiți ca martor. Volumul tumorii a fost estimat folosind măsurarea calibrului digital (0,5 × lungime × lățime × lățime) de două ori pe săptămână. Șoarecii au fost eutanasiați când volumul tumorii a atins 2.000 mm3 .

In vivo Mouse IFN-β și blocare IFN de tip I

Șoarecii purtători de tumori au fost injectați i.t. cu 50 μg poli I: C. Sângele periferic a fost colectat din venele obrazului la orele indicate. Soluția salină a fost folosită ca martor. Nivelul IFN-β din seruri a fost cuantificat cu ELISA. Pentru a interfera cu semnalizarea IFN de tip I, 50 μg anti-IFNAR1 mAb (clona MAR1-5A3, Bioxcell) a fost injectat intratumoral în ziua 0 și 2 după tratamentul cu poli I: C sau soluție salină (22).

PCR în timp real pentru persistența celulelor CAR-T

Pentru a determina numărul de exemplare al CAR integrat în celulele T modificate genetic, 100 ng ADN genomic ADN a fost extras din tumorile șoarecilor tratați cu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). ADN-ul a fost amplificat în triplicat cu primeri și sonde TaqMan specifice pentru transgenele CAR, folosind 7.500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) într-o reacție PCR (2 min pentru 50 ° C, 10 min pentru 95 ° C, urmată de 45 de cicluri de 15 s 95 ° C și 1 min 60 ° C). Pentru a genera standarde ADN, am stabilit diluarea în serie a plasmidelor ADN care codifică caseta specifică. Primerii utilizați au fost după cum urmează: Primer-F: 5′- GACGTTGGGTTACCTTCTG C-3 ′), Primer-R: 5′- TTCCCAGGTCACGATGTAGG - 3 ′ și sonda: 5 ′ - (FAM) -ATGGCCGCGA GACGGCACCT- (BHQ1 -3) ′.

Testele de suprimare MDSC

MDSC-urile au fost izolate prin selecție magnetică Ly6G din spline de șoareci purtători de tumori la 24 de ore după poli I: C sau tratament salin. MDSC izolate au fost titrate în culturi de celule CAR-T la un raport variabil de celule MDSC: CAR-T și incubate peste noapte. Pentru testele de proliferare pe bază de citometrie în flux, celulele T de șoarece au fost pre-marcate cu CSFE (ThermoFisher Scientific). Au fost adăugate dinabele acoperite cu anti-CD3 și anti-C28 Abs la momentul inițial. După 72 de ore, celulele au fost colectate și expresia CFSE a fost detectată prin citometrie în flux.

Pentru a evalua suprimarea MDSC asupra activității litice CAR-T, celulele CAR-T și celulele țintă au fost co-cultivate la un raport E: T de 0,3: 1. MDSC izolate au fost adăugate la diferite rapoarte MDSC: celule CAR-T. Eficiența citotoxicității a fost calculată după 18 ore de co-incubare.

In vivo Gr1 + epuizarea celulei

Șoarecii purtători de tumori au fost tratați cu celule poli I: C și CAR-T așa cum s-a descris mai sus. Se epuizează in vivo MDSC, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu mAb anti-Gr1 (10 mg/kg, clonă RB6-8C5, BioXell) cu 24 de ore înainte de poli I: C inițial și apoi de trei ori pe săptămână timp de 2 săptămâni (23). Depleția MDSC a fost validată prin analiza prin citometrie în flux a celulelor circulante CD11b + Gr1 + în sângele periferic o zi mai târziu. Șoarecii martori au fost injectați cu mAb martor IgG (10 mg/kg, clonă LTF-2, BioXcell). Creșterea tumorii a fost monitorizată de două ori pe săptămână. Șoarecii au fost eutanasiați când volumul tumorii a atins 2.000 mm3 .

Analize statistice

În toate experimentele, semnificația statistică a fost evaluată cu nepereche t-test la compararea a două grupuri și ANOVA unidirecțional, urmată de analiza post Newman-Keuls pentru comparații de 3 sau mai multe grupuri. ANOVA bidirecțională cu Bonferroni post-teste a fost obișnuită la compararea a două grupuri cu două probe diferite. Compilarea graficelor și analizele statistice au fost efectuate cu software-ul Prism (GraphPad). Datele au fost prezentate ca valori medii ± SEM. În toate cazurile, p-valori Cuvinte cheie: receptor antigenic himeric, poli I: C, tumoare solidă, MDSC, IFN tip I

Citat: Di S, Zhou M, Pan Z, Sun R, Chen M, Jiang H, Shi B, Luo H și Li Z (2019) Adjuvant combinat al Poly I: C Îmbunătățește efectele antitumorale ale celulelor CAR-T. Față. Oncol. 9: 241. doi: 10.3389/fonc.2019.00241

Primit: 02 decembrie 2018; Acceptat: 18 martie 2019;
Publicat: 17 aprilie 2019.

Rayne Rouce, Baylor College of Medicine, Statele Unite

Yang Xu, Universitatea din Carolina de Nord la Chapel Hill, Statele Unite
Robin Parihar, Baylor College of Medicine, Statele Unite