Simbioze microbiene

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Riscul apariției substanțelor periculoase din dietă și impactul asupra microbiotei umane: rol posibil în mai multe fenotipuri de disbioză Vizualizați toate cele 7 articole

Editat de
Margarita Aguilera

Universitatea din Granada, Spania

Revizuite de
Emilie Viennois

INSERM U1149 Centrul de căutare pentru inflamație, Franța

Alex Rodriguez-Palacios

Departamentul de Medicină, Case Western Reserve University, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontierele

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laboratorul cheie de medicină radiațională și moleculară nucleară moleculară din Tianjin, Institutul de medicină radiațională, Academia chineză de științe medicale și Colegiul medical al Uniunii din Beijing, Tianjin, China
  • 2 Departamentul de Medicină de Urgență, North Shore University Hospital, Manhasset, NY, Statele Unite
  • 3 Laboratorul de Medicină de Urgență, Institutul Feinstein pentru Cercetări Medicale, Manhasset, NY, Statele Unite

Introducere

Cancerele pelvinei și abdominale sunt tumori frecvente care afectează funcțiile gastro-intestinale (GI), genito-urinare și ginecologice (Pal și colab., 2019). Datorită dimensiunilor lor mari și ușurinței de răspândire în alte organe abdominale și în sistemul limfatic, cancerele pelvine și abdominale sunt din ce în ce mai tratate de rutină prin radioterapie (Liauw și colab., 2013; Citrin, 2017). După radioterapie, mulți pacienți cu cancer pelvin și abdominal suferă de sindroame GI (SIG) (Peterson și colab., 2010; Hauer-Jensen și colab., 2014), cum ar fi malabsorbția, enterita bacteriană și diareea, care afectează negativ tratamentul și pot chiar duc la moarte. Aceste complicații acute și cronice au devenit provocări majore pentru oncologii cu radiații și fizicienii medicali. Prin urmare, identificarea factorilor potențiali de risc care pot influența negativ prognosticul pacienților cu cancer după radioterapie și dezvoltarea unor abordări terapeutice noi sunt de urgență.

Emulsifianții sunt o clasă de molecule asemănătoare detergenților care se adaugă în mod obișnuit la alimentele procesate, preparatele farmaceutice și produsele cosmetice. Emulsifianții alimentari utilizați în mod obișnuit includ esterii Tween, Span, lactat de sodiu stearil (SSL) și propilen glicol al acizilor grași. De exemplu, Tween 80 (sau polisorbat-80, P80) este un aditiv alimentar utilizat pe scară largă, care conferă o consistență lină și stabilă tortului, ciocolatei, înghețatei și altor gustări ambalate. În plus, P80 este, de asemenea, utilizat ca agent de dispersie, solubilizant și stabilizator pentru preparate medicinale insolubile (de exemplu, injecții cu etopozid și docetaxel) pentru terapia cancerului (Iusuf și colab., 2015; Al-Ali și colab., 2018). Datorită potențialului său de toxicitate și carcinogenitate, P80 a fost utilizat în doze limitate (până la 1,0%) (Food Safety Commission [din Japonia], 2007; Roberts și colab., 2013). Cu toate acestea, consumul crescut de P80 în ultima jumătate de secol este asociat cu incidența crescândă a diferitelor boli cronice inflamatorii și metabolice (Chassaing și colab., 2015), în special coroborate cu modificări ale compozițiilor și translocarea microbiotei intestinale ( Roberts și colab., 2010). În mod ironic, pacienților cu cancer li s-ar administra alimente și medicamente care conțin P80 în timpul radioterapiei. Prin urmare, dacă consumul de P80 afectează în mod negativ eficacitatea radioterapiei rămâne puțin înțeles.

Tractul GI este locuit de o comunitate de trilioane de microbi care sunt denumiți în mod colectiv microbiota intestinală (Gopalakrishnan și colab., 2018). Microbiota intestinală oferă beneficii cruciale gazdelor, inclusiv facilitarea digestiei alimentelor și dezvoltarea sistemelor metabolice și imune (Holmes și colab., 2012; Wrzosek și colab., 2013). Între timp, perturbarea sau translocarea microbilor enterici poate duce, de asemenea, la o serie de procese patologice (Clemente și colab., 2012; Lichtman și colab., 2016), cum ar fi colita cronică (Gevers și colab., 2014)., Clostridium difficile-boală asociată (Ghose, 2013; Peng și colab., 2018) și boala Crohn (Mottawea și colab., 2016). Tulburările microbiotei intestinale sunt, de asemenea, comorbide cu o serie de boli psihiatrice și boli metabolice sistemice, cum ar fi anxietatea (Heijtz și colab., 2011), infecția cu virusul imunodeficienței umane (HIV) (Sun și colab., 2016) și nealcoolică boală a ficatului gras (Chu și colab., 2019). Într-adevăr, dovezi substanțiale sugerează o asociere pozitivă între radioterapie și dezvoltarea colitei (Kirsch și colab., 2010; Andreyev și colab., 2013), precum și modificări semnificative ale compoziției microbiotei intestinale după radioterapie (Cui și colab., 2016, 2017a).

În acest studiu, ne-am propus să determinăm dacă consumul de P80 duce la alterarea dăunătoare a microbiotei intestinale și exacerbează leziunile intestinale induse de radiații (RIII). Observațiile noastre au demonstrat că consumul de P80 a modificat compoziția microbiotei intestinale și a înrăutățit toxicitatea GI indusă de radiații. Important, administrarea de butirat pe cale orală a atenuat efectele nocive ale P80 la animalele iradiate. Luate împreună, descoperirile noastre au identificat că P80 este un factor de risc pentru pacienții cu cancer în timpul radioterapiei și au indicat faptul că butiratul ar putea fi utilizat ca opțiune terapeutică pentru protecția împotriva toxicității GI asociate cu radiațiile în medii preclinice.

Materiale și metode

Animale

Acest experiment a testat grupuri (12 șoareci per grup) de șoareci masculi C57BL/6J în vârstă de 6-8 săptămâni, găzduiți utilizând cușcă ventilată individuală ca șase șoareci pe cușcă pentru a furniza o putere de studiu de 80%. Șoarecii experimentali au fost tratați cu 200 ul P80 (1,0% în apă sterilă) administrat pe cale orală timp de 7 zile, apa sterilă a fost utilizată ca martor. Nu a fost folosit niciun echipament specializat. Biasul ciclic a fost controlat după cum urmează. Șoarecii au fost alocați aleatoriu grupurilor de tratament, nu mai mult de șase șoareci pe cușcă pentru a se asigura că zona activă a fiecărui șoarece nu a fost mai mică de 0,01 m 2. Șoarecii au fost întreținuți pe substraturi de rumeguș curate și au fost hrăniți cu alimente cu peleți autoclavate (ciclu umed de 60 min) (Cat # 1022, HFK Bioscience, Beijing, China, ≤5% CHO, ≥18% PRO, ≥4% FAT/kg) și autoclavate apă filtrată (pH în jur de 5) ad libitum. Pentru a preveni așternutul murdar, materialul de așternut a fost schimbat la fiecare 2 zile, iar șoarecii din aceeași cohortă au fost amestecați și re-separați la fiecare 2 zile pe parcursul întregului experiment, pentru a evita efectele coprofagiei asupra microbiomului intestinal. Alimentele/apa au fost înlocuite la fiecare 4 zile. Un protocol de co-locuință a fost utilizat înainte de începerea tuturor experimentelor. Fecalele proaspete murine au fost colectate în mod obișnuit dimineața a doua zi după înlocuirea cuștii și depozitate timp de aproximativ 30 de zile la -80 ° C până la analiză.

Administrare Polisorbat-80 (P80)

P80 a fost achiziționat de la Sigma (Spania, Cat # 59924). În acest studiu, consumul de P80 a fost efectuat prin gavaj oral de 200 μl timp de 7 zile (concentrația de P80, 1,0% în apă sterilă) la șoareci înainte de expunerea la iradiere abdominală și durează până la sfârșitul experimentului. Aceeași apă a fost utilizată ca vehicul pentru grupul tratat cu apă (control).

Model de leziuni intestinale induse de radiații

Pentru toate experimentele a fost utilizat un Exector Gammacell ® 40 (Energie Atomică din Canada Lim, Canada). Șoarecii de sex masculin (aproximativ 20 g în greutate corporală) au fost tratați cu o singură doză de 12 Gy sau 15 Gy raze γ la o rată de 1,0 Gy/min (testare prin măsurarea ratei dozei purtată de Exactor) iradiere abdominală totală (TAI) folosind o cameră de oțel specifică, iar doza de radiații a fost monitorizată de un contor de doză. După iradiere, șoarecii au fost returnați la unitatea pentru animale pentru observare și tratament zilnic, așa cum s-a descris mai sus. Șoarecii din toate grupurile au fost monitorizați pentru starea de supraviețuire pe parcursul celor 30 de zile ale experimentului și apoi sacrificați pentru a colecta probe de țesut pentru examinări structurale și funcționale grosiere.

Colorarea hematoxilinei și a eozinei (HE)

După eutanasie, intestinele subțiri și colonele șoarecilor au fost fixate în formolă tamponată 4% peste noapte la temperatura camerei și apoi încorporate în parafină. Țesuturile au fost secționate la 5 μm grosime și înmuiate în hematoxilină și eozină (Solarbio, China) folosind protocoale standard.

Colorare periodică cu acid-Schiff (PAS)

Țesuturile intestinului subțire au fost fixate în soluție Carnoy (60% etanol uscat, 30% cloroform, 10% acid acetic glacial) (Jiangtian Chemical Technology, China) peste noapte, iar secțiunile de parafină de 5 μm au fost deparafinizate și oxidate în acid periodic 1% (Solarbio, China) timp de 10 min, după clătire, țesuturile au fost incubate în reactivul Schiff (Solarbio, China) timp de 10 min, spălate în apă caldă și contracolorate cu hematoxilină (Solarbio, China) timp de 30 s, spălate și deshidratate înainte de montare.

Analiza microbiotei fecale

Pentru acest studiu, probele de scaun au fost recoltate proaspăt de la cinci șoareci în cuști diferite, așa cum s-a descris anterior (Cui și colab., 2017b), și apoi depozitate la -80 ° C până la utilizare. ADN-ul a fost extras din probele de scaun folosind Power Fecal ® DNA Isolation Kit (MoBio, Carlsbad, CA, Statele Unite). ADN-ul a fost recuperat cu 30 pl de tampon în kit. Amplificarea și secvențierea genei V4 ARN ribozomal (rRNA) V4 s-au făcut folosind tehnologia Illumina MiSeq. Biblioteca a fost secvențiată pe un Illumina HiSeq 2500 și au fost generate citiri de capăt pereche de 250 bp. Analizele de secvență au fost efectuate de software-ul Uparse (Uparse v7.0.1001 1). Secvențe cu similaritate ≥97% au fost atribuite acelorași OTU. Secvența reprezentativă pentru fiecare OTU a fost selectată pentru adnotare ulterioară. Pentru fiecare secvență reprezentativă, baza de date Silva123 a fost utilizată pe baza algoritmului clasificator RDP (Versiunea 2.2 2) pentru adnotarea informațiilor taxonomice. Diferența statistică a secvențierii de înaltă viteză a ARNr 16S a fost evaluată de HSD-ul Tukey. Primerii sunt enumerați în tabelul suplimentar S1.

Administrația Butiratului

Pentru șoareci de grup tratați cu butirat, butiratul de sodiu (Tokyo Chemical Industry, Japonia) a fost gavat în fiecare zi timp de 10 zile consecutive după 12 Gy TAI. Fecalele proaspete au fost colectate înainte și după 7 zile de tratament cu P80, precum și la 7 zile după remedierea butiratului, respectiv, pentru analiza din aval.

Administrarea cocktailului antibiotic (ABX)

ABX a constat din ciprofloxacină (0,125 g/l), metronidazol (0,1 g/l), vancomicină (0,05 g/l), streptomicină (100 U/l) și penicilină (100 U/l). Șoarecii au fost expuși la ABX în apă potabilă după TAI. Aceeași apă a fost utilizată pentru grupul tratat cu apă (TAI + P80).

Măsurători ale acizilor grași cu lanț scurt (SCFA)

Cuantificarea acizilor grași cu lanț scurt a fost efectuată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) (Thermo Fisher, Statele Unite) în supernatanți ai probelor de fecale reconstituite în PBS. Pe scurt, 1 ml de soluție fecală a fost acidulată cu 1/10 volum de H2SO4 (0,01 M) și trecut printr-un condensator pentru a izola compușii volatili dintr-o probă. După filtrarea prin membrană de 0,45 μm, volum egal de probe a fost încărcat pe coloana cromatografică HPLC: C18 AQ (4,6 ± 250 mm), acid sulfuric (0,01 M) a fost folosit ca fază mobilă, iar nivelul SCFA a fost determinat de metoda standard de calibrare.

Transplantul de microbiote fecale (FMT)

Pentru experimentele FMT, materialele proaspete de transplant au fost preparate în aceeași zi de transplant în decurs de 4 ore înainte de perfuzia gastrică pentru a preveni modificările compoziției bacteriene (Cui și colab., 2017b). În special, 200 mg de scaune de la șoareci tratați cu P80 au fost resuspendate în 2 ml soluție salină sterilă, vortexate timp de 30 s și lăsate să stea 30 min anaerob. Șoarecii de sex masculin C57BL/6J de opt săptămâni au fost administrați zilnic pe cale orală cu supernatantul timp de 10 zile înainte de 12 Gy TAI și menținuți pe apă sterilă pe tot parcursul experimentului.

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR)

ARN-ul total a fost separat de țesuturi sau celule folosind Trizol (Invitrogen, Statele Unite), în conformitate cu protocolul producătorului. ADNc a fost sintetizat din ARN total utilizând poli (A) - coada ARN total și exemplul de transcriere inversă cu ImPro-II Reverse Transcriptase (Promega, Statele Unite), conform protocolului producătorului. RT-PCR a fost realizat folosind DreamTaq ™ Hot Start Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, CA, Statele Unite), în conformitate cu protocolul producătorului. QRT-PCR a fost efectuat conform instrucțiunilor Fast Start Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche Diagnostics GmbH, Germania). GAPDH a fost folosit ca genă de menaj. Expresia genei a fost indicată cu 2 –ΔΔCt și normalizată la GAPDH. Mai exact, 2 –ΔΔCt calculat în grupul de control a fost setat la 1, expresia genei în grupul experimental a fost evaluată ca 2 –ΔΔCt (grup experimental)/2 –ΔΔCt (grup de control). Primerii utilizați în acest studiu au fost enumerați în tabelul suplimentar S2.

Măsurători P80 reziduale

Cuantificarea P80 reziduală a fost efectuată prin HPLC în supernatanți ai probelor fecale. Analiza cromatografică a fost efectuată pe un Dionex Ultimate 3000 (Dionex, Statele Unite), iar faza mobilă a constat din 20 mM acetat de amoniu și acetonitril (9: 1). După filtrarea prin membrană de 0,45 μm, volum egal de probe a fost încărcat pe HPLC. Debitul a fost de 0,6 ml/min, iar temperatura coloanei a fost de 30 ° C.

Colorarea imunohistochimiei (IHC)

După eutanasie, colonii de șoareci au fost fixați în fixare carnoy peste noapte la temperatura camerei și apoi încorporați în parafină. Țesuturile au fost secționate la 5 μm grosime și blocate cu 5% BSA (Solarbio, China) timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi incubate cu anticorpi primari peste noapte la 4 ° C și incubate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) -conjugat cu capră anti-iepure Anticorp IgG (ZSGB Bio, China) timp de 1 oră la temperatura camerei, apoi colorat cu DAB Staining Kit (ZSGB Bio, China), urmat de contracolorarea nucleară a hematoxilinei. A fost utilizat anticorpul primar al iepurelui anti-MUC2 (Abcam, Statele Unite).

Cuantificarea LCN2 și IL-10 fecale

Probele de fecale congelate au fost resuspendate în PBS conținând 0,1% Tween 20 (Jiangtian Chemical Technology, China) la o concentrație finală de 0,1 g/ml, apoi rotite pentru a produce o suspensie fecală omogenă, urmată de centrifugare timp de 10 minute la 14.000 × g și 4 ° C. Nivelurile LCN2 și IL-10 au fost măsurate de la supernatantul clar folosind kitul ELISA Mouse Lipocalin (LCN2) (Solarbio, China) sau kitul ELISA Mouse IL-10 (Solarbio, China) conform protocolului producătorului. Citiți valoarea OD 450 nm cu un cititor de plăci de microtitrare (Rayto, China). Mai exact, cu valoarea DO a absorbanței ca ordonată (Y) și concentrația LCN2 standard (sau IL-10) care trebuie măsurată ca abscisă (X), se realizează curba corespunzătoare. Conținutul LCN2 (sau IL-10) care trebuie măsurat în eșantion poate fi convertit de la curba standard la concentrația corespunzătoare în funcție de valoarea sa OD.

Cultură de celule

Linia de celule enterocite umane HIEC-6 a fost cultivată în mediu RPMI-1640 (Gibco, CA, Statele Unite) suplimentat cu 10% ser de bromură fetală (FBS) (Gibco, CA, Statele Unite) la 37 ° C într-o umiditate 100% atmosferă de 5% CO2.

Transfecția celulară

Pentru transfecția celulară, celulele au fost cultivate într-o placă cu 6 godeuri timp de 24 de ore și apoi au fost transfectate cu ARNsi. Toate transfecțiile au fost efectuate folosind polieterimidă (PEI) (Sigma, Spania) conform protocolului producătorului. si-GPR43 a fost sintetizat de RiboBio (Guangzhou, China). Secvențele de ARNsi au fost enumerate în Tabelul suplimentar S3.

Analize statistice

Fiecare experiment a fost repetat de cel puțin trei ori. Semnificația a fost evaluată prin compararea valorilor medii (6 deviație standard; SD) folosind Student's t-testați fiecare dintre două cohorte după cum urmează: *p # p Cuvinte cheie: emulgator, enteropatie radiațională, microbiota intestinală, metabolit intestinal microbiota, GPR43

Citare: Li Y, Xiao H, Dong J, Luo D, Wang H, Zhang S, Zhu T, Zhu C, Cui M și Fan S (2020) Metabolitul microbiotei intestinale luptă împotriva polisorbatului dietetic 80-Enterită de radiație agravată. Față. Microbiol. 11: 1450. doi: 10.3389/fmicb.2020.01450

Primit: 19 decembrie 2019; Acceptat: 04 iunie 2020;
Publicat: 26 iunie 2020.

Margarita Aguilera, Universitatea din Granada, Spania

Emilie Viennois, INSERM U1149 Centre for Research on Inflammation, Franța
Alexander Rodriguez-Palacios, Case Western Reserve University, Statele Unite

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare