Fiziologie clinică și translațională

Editat de
Gabriele G. Schiattarella

Universitatea din Napoli Federico II, Italia

Revizuite de
Markus Niessen

Universitatea din Zurich, Elveția

Hai-Bin Rouen

Facultatea de Medicină, Universitatea din Minnesota, Statele Unite

Theodore F. Towse

Grand Valley State University, Statele Unite ale AmericiiΑ

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

zinc-α2-glicoproteina

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • Laboratorul cheie de endocrinologie a sănătății naționale și a Comisiei de planificare familială, Departamentul de endocrinologie, Spitalul Colegiului Medical din Uniunea Beijing, Academia Chineză de Științe Medicale și Colegiul Medical al Uniunii din Beijing, Beijing, China

Introducere

1,4 miliarde de oameni la nivel mondial, atinge proporții epidemice (O'Neill și O'Driscoll, 2015). Având în vedere prevalența crescândă a obezității și comorbiditățile asociate sale care pun viața în pericol, inclusiv diabetul de tip 2, sindromul metabolic și bolile cardiovasculare, este urgentă necesitatea explorării patogeniei obezității și a dezvoltării unor strategii eficiente de tratament sau prevenire (Harms și Seale, 2013) . Prin urmare, țesutul adipos alb (WAT), cel mai mare organ de stocare a energiei din corpul uman, a atras o mare atenție din partea cercetătorilor din întreaga lume.

S-a raportat că ZAG și-a exercitat efectul parțial prin inhibarea lipogenezei, precum și prin stimularea lipolizei și a utilizării lipidelor (Sanders și Tisdale, 2004; Gong și colab., 2009; Russell și Tisdale, 2011). Efectele ZAG au fost mediate prin interacțiunea cu receptorul β3-adrenergic (β3-AR) și pot fi atenuate de antagonistul β3-AR specific SR59230 (Russell și colab., 2004). Interesant, un al treilea tip de adipocit în WAT, numit celule „bej” sau „brite”, a fost descoperit recent și studiile au demonstrat că acele celule pot fi activate la activarea farmacologică a β3-AR și că exprimă foarte mult proteina de decuplare 1 ( UCP1), apoi disipează energia (Fisher și colab., 2012; Harms și Seale, 2013; Poher și colab., 2015). În acest context, activarea rumenirii WAT ar putea fi o terapie promițătoare pentru obezitate și bolile sale metabolice conexe (Harms și Seale, 2013; Kajimura și colab., 2015). Studii anterioare in vivo (Russell și Tisdale, 2012a) și in vitro (Sanders și Tisdale, 2004) au demonstrat că ZAG ar putea crește expresia UCP1 în țesutul adipos maro (BAT). Cu toate acestea, nu este încă clar dacă ZAG are vreun efect asupra rumenirii WAT.

Prin urmare, în acest studiu, ne-am propus să determinăm nivelurile de ZAG în ser și ZAG nivelurile de ARNm în WAT subcutanat (sWAT) și pentru a explora asocierea acestuia cu parametrii legați de obezitate la subiecții slabi și supraponderali/obezi. Mai mult, am investigat efectele supraexprimării ZAG asupra greutății corporale, a grăsimii corporale și a metabolismului glucozei la șoarecii obezi induși de HFD, precum și posibilele sale ținte de reglementare în țesutul adipos, ficatul și mușchiul scheletic.

Materiale și metode

Studiu uman

Un total de 40 de pacienți supraponderali/obezi (IMC ≥ 24, vârstă 42,8 ± 4,5 ani) și 40 de subiecți de control slab (IMC -2). Toți subiecții recrutați au primit examene fizice și clinice, iar probele de sânge au fost colectate după un post peste noapte pentru măsurători biochimice. Insulina de post a fost măsurată printr-un sistem Siemens Centaur XP (Siemens, Tarrytown, SUA), iar estimarea evaluării modelului de homeostazie a rezistenței la insulină (HOMA-IR) a fost calculată ca insulină de post (mU L −1) × glucoză de post (mmol L - 1)/22,5 (Wallace și colab., 2004). Concentrațiile serice de ZAG au fost determinate prin seturi de testare imunosorbentă legată de enzime ZAG umane disponibile în comerț (ELISA) (Biovendor Laboratory Medicine, Modrice, Republica Cehă) conform instrucțiunilor producătorului. Coeficienții de variație intra-test și inter-test au fost de 3,9 și respectiv 6,6%.

Țesutul sWAT uman a fost colectat de la 40 de pacienți obezi morbid (IMC ≥ 40) sau pacienți obezi (formula 35 ≦ IMC −ΔΔCt) (Livak și Schmittgen, 2001).

Animale și tratament

Șoareci masculi ICR de opt săptămâni (cu greutatea de 27-30 g, n = 31, achiziționat de la HFK Bioscience Co. LTD, Beijing, China) au fost adăpostite la Institutul de Științe Animale de Laborator, CAMS și PUMC, la o temperatură ambiantă de 22 ± 1 ° C sub un ciclu de lumină/întuneric de 12/12 h și alimentate ad libitum. După 1 săptămână de aclimatizare, șoarecii au fost cântăriți și apoi împărțiți în mod aleatoriu în grupul de alimente standard (SF) (n = 10), care a primit SF (proteine ​​22%, grăsimi 11% și carbohidrați 67%) și grupul HFDn = 21), care a primit HFD (proteină 42%, grăsimi 41% și carbohidrați 17%). Toate protocoalele experimentale pe animale au fost efectuate în conformitate cu standardele Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și aprobate de comitetul de etică al Spitalului Universitar Medical Medical din Beijing.

După 8 săptămâni, șoarecii hrăniți cu HFD au fost cântăriți și împărțiți aleatoriu în grupul HFD simplu (n = 13, HFD + pcDNA3.1 (+) plasmidă de control) și grupul de supraexpresie ZAGn = 8, plasmidă de expresie HFD + ZAG). Șoarecii din grupul SF au fost, de asemenea, injectați intraperitoneal cu un volum egal de pcDNA3.1 (+) plasmidă de control (n = 10, SF + pcDNA3.1 (+) plasmidă de control). Transfecția plasmidică a șoarecilor a fost efectuată așa cum a fost descris în studiul nostru anterior (Gong și colab., 2009). Pe scurt, plasmida de expresie ZAG (5 μg fiecare) sau pcDNA3.1 (+) plasmidă de control negativă (5 μg fiecare) în 150 μL de mediu OPTI-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) a fost amestecată bine cu Lipofectamina 2000 10 μL, Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) în 150 μL de mediu OPTI-MEM și totalul de 300 μL de amestec a fost incubat la temperatura camerei timp de 30 min, apoi injectat intraperitoneal la șoareci. Această injecție a fost efectuată la o frecvență de patru ori pe săptămână timp de 8 săptămâni. Greutatea corporală a tuturor șoarecilor a fost înregistrată în mod obișnuit o dată pe săptămână.

Testul de toleranță la insulină intraperitoneală (IPITT) și Testul de toleranță la glucoză intraperitoneal (IPGTT)

La sfârșitul intervenției, au fost efectuate IPITT și IPGTT. Pentru IPITT, șoarecii au fost posti timp de 5 ore, iar apoi insulina (Humulin R, Lilly, SUA, 0,75 U/kg) a fost administrată intraperitoneal; glicemia a fost măsurată în vena cozii la 0, 30, 60, 90 și 120 min cu un glucometru (Roche, Basel, Elveția). Pentru IPGTT, șoarecii au fost postiti peste noapte, apoi 50% glucoza a fost injectata intraperitoneal la o doza de 2 g/kg, iar glucoza din sange a fost masurata ca in IPITT. În plus, aria de sub curbă (ASC) a concentrației de glucoză între 0 și 120 min a fost calculată atât pentru IPITT, cât și pentru IPGTT.

Colecția de probe de țesut și măsurători Parametri biochimici

După 8 săptămâni de intervenție ZAG, WAT (inclusiv inghinal (iWAT), mezenteric (mVAT), perirenal (pVAT) și epididimal (eVAT) țesut adipos alb) și BAT (țesut adipos maro intercapular) au fost excizate și cântărite. De asemenea, au fost colectate probe de țesut din ficat și mușchiul scheletal al membrului posterior drept. Colesterolul total seric (TC), trigliceridele (TG), acizii grași liberi, colesterolul lipoproteic cu densitate mică (LDL-C), colesterolul lipoproteic cu densitate ridicată (HDL-C) și nivelul glicemiei la jeun au fost determinate prin metode de laborator automatizate de rutină, iar insulina serică de post a fost determinată de un kit ELISA de insulină de șoarece disponibil în comerț (Linco Research Inc., MO, SUA). Coeficientul de variație intra-test pentru insulină a fost de 5,9%.

Colorarea morfologică și imunohistochimică a țesutului adipos la șoareci

Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) și colorarea imunohistochimică UCP1 au fost efectuate la șoarece iWAT conform procedurilor standard. Un anticorp policlonal primar de iepure împotriva UCP1 (diluție 1: 200, Abcam, Cambridge, Marea Britanie) și un anticorp secundar IgG anti-iepure de capră (diluție 1: 2.000, ZSGB-BIO, Beijing, China) au fost folosiți în acest proces. Toate secțiunile pentru colorarea UCP1 au fost contracolorate cu hematoxilină Harris (Histolab, Gothenburg, Suedia) și observate prin microscopie cu lumină.

Izolarea ARN și transcrierea inversă cantitativă PCR (RT-qPCR) Analiza țesuturilor șoarecilor

Extracția totală de ARN din țesutul WAT, ficatul și mușchii scheletici de șoarece și transcrierea inversă ulterioară au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus pentru țesutul adipos uman. Exemplele de secvențe pentru genele țintă și genele de control intern au fost enumerate în tabelul suplimentar 2. Nivelurile de expresie ale genelor țintă în WAT și mușchiul scheletic au fost normalizate la cele ale peptidilprolil izomerazei A (PPIA), iar nivelurile de expresie în ficat au fost normalizate la cea a β-actinei. Rezultatele au fost exprimate ca modificări ale pliurilor în valoarea Ct în raport cu controlul conform formulei de 2 −ΔΔCt (Livak și Schmittgen, 2001).

Analiza Western Blot

Proteinele totale au fost extrase din iWAT și pVAT de șoarece folosind un kit de extracție a proteinelor totale (Applygen, Beijing, China), iar concentrațiile de proteine ​​au fost măsurate cu un kit de reactivi de testare a proteinei BCA (Applygen, Beijing, China). Aproximativ 30 μg de proteine ​​au fost separate pe geluri SDS-PAGE 10% și transferate pe membrane de nitroceluloză (Millipore, Billerica, MA, SUA) printr-un transfer umed (BIO-RAD, California, SUA). Membranele au fost incubate cu anticorpii primari (anti-UCP1, Proteintech, Wuhan, China; anti-PGC1α, Proteintech, Wuhan, China; anti-ZAG, Santa Cruz, Dallas, SUA; anti-β-actină, CST, Danvers, MA, SUA; anti-GAPDH, CST, Danvers, MA, SUA) la o diluție de 1: 100 la 1: 1.000 la 4 ° C peste noapte, urmată de incubare cu un anticorp secundar anti-șoarece/iepure de capră la 1: 5.000 diluare timp de 1 oră (ZSGB-BIO, Beijing, China). Benzile de proteine ​​specifice au fost vizualizate prin chemiluminescență îmbunătățită (Applygen, Beijing, China). Benzile de proteine ​​au fost cuantificate prin software-ul Quantity One (versiunea 4.6.9, BIO-RAD, California, SUA). Nivelurile de expresie ale proteinelor țintă din iWAT au fost normalizate la cele ale β-actinei, iar nivelurile de expresie din pVAT au fost normalizate la cele ale GAPDH.

Analize statistice

Toate datele sunt afișate ca medie ± s.e.m. cu excepția cazului în care se indică altfel. Distribuția normală a datelor a fost testată folosind testul Shapiro-Wilk. Parametrii distribuiți în mod normal au fost transformați logaritmic într-o distribuție normală. ANOVA cu un singur sens și T3-ul lui Dunnett post-hoc testul a fost folosit pentru a analiza diferențele dintre grupuri. Coeficienții de corelație Pearson și parțiale au fost folosiți pentru a determina asocierea liniară între ZAG și alți parametri. Toate calculele statistice au fost efectuate în SPSS 20.0 pentru Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, SUA), P # P # P # P # P Cuvinte cheie: Zinc-α2-glicoproteină (ZAG), obezitate, metabolismul glucozei, țesut adipos alb, receptor activat de proliferator peroxizom gamma coactivator 1 alfa (PGC1a)

Citare: Liu M, Zhu H, Dai Y, Pan H, Li N, Wang L, Yang H, Yan K și Gong F (2018) Zinc-α2-Glicoproteina este asociată cu obezitatea la populația chineză și la șoarecii obezi induși de HFD. Față. Fiziol. 9:62. doi: 10.3389/fphys.2018.00062

Primit: 16 august 2017; Acceptat: 18 ianuarie 2018;
Publicat: 07 februarie 2018.

Gabriele Giacomo Schiattarella, Universitatea din Napoli Federico II, Italia

Markus Niessen, Universitatea din Zurich, Elveția
Hai-Bin Rouen, Universitatea din Minnesota, Statele Unite
Theodore Francis Towse, Universitatea de Stat Grand Valley, Statele Unite