ABSTRACT

fundal Nu este clar modul în care consumul ridicat de fructoză induce răspunsuri metabolice disparate la tulpini de șoareci genetic diverse.

gazdă

Obiectiv Ne propunem să investigăm dacă microbiota intestinală contribuie la răspunsuri metabolice diferențiate la fructoză.

Metode Șoarecilor masculi C57BL/6J (B6), DBA/2J (DBA) și FVB/NJ (FVB) de opt săptămâni li s-a administrat o soluție de fructoză 8% sau apă regulată (martor) timp de 12 săptămâni. Compoziția microbiotei intestinale în cecum și fecale a fost analizată utilizând secvențierea 16S rADN și PERMANOVA a fost utilizat pentru a compara comunitatea între tulpini de șoareci, tratamente și puncte de timp. Abundența microbiotei a fost corelată cu fenotipurile metabolice și expresia genei gazdei în hipotalamus, ficat și țesuturi adipoase utilizând corelarea bi-greutate. Pentru a testa rolul cauzal al microbiotei intestinale în determinarea răspunsului la fructoză, am efectuat transplanturi fecale de la șoareci B6 la șoareci DBA și invers timp de 4 săptămâni, precum și șoareci DBA tratați cu antibiotice cu Akkermansia timp de 9 săptămâni, însoțiți cu sau fără fructoză tratament.

Rezultate În comparație cu B6 și FVB, șoarecii DBA au avut un raport Firmicutes/Bacteroidetes semnificativ mai ridicat și niveluri inițiale mai mici de Akkermansia și S24-7 (P 9 cfu/mL în PBS anaerob) pe tot parcursul experimentului. După 1 săptămână de gavaj bacterian, șoarecii DBA au fost tratați cu 8% fructoză sau apă obișnuită timp de 8 săptămâni (n = 10-14/grup). Șoarecii DBA care au primit PBS anaerob au servit ca martor (n = 8-10/grup). Greutatea corporală și IPGTT au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (5).

analize statistice

Datele microbiotei au fost rezumate în abundență relativă în funcție de nivelul taxonomic în QIIME, iar comunitățile au fost vizualizate cu analiza coordonatelor principale (PCoA) pe baza măsurării ponderate a distanței UniFrac (23). Grupurile categorice (tratament, timp, tulpină de șoarece) s-au confirmat că au o omogenitate multivariată similară a dispersiilor de grup pentru a le permite să fie comparate folosind testul PERMANOVA (analiza permutatională multivariată a varianței) non-parametric cu funcția adonis (24). Compoziția microbiană a fost analizată la nivelurile taxonomice filum, familie și gen folosind software-ul Analiza statistică a profilurilor metagenomice (STAMP) (25).

Mărimea efectului de analiză discriminantă liniară (LDA) (LEfSe) a fost utilizată pentru a identifica taxonii reprezentați diferențial între trei tulpini de șoarece folosind parametri standard (P 2.0) (26). Folosind caracteristicile identificate din analiza LEfSe, am selectat șase genuri fecale care au prezentat modele contrastante în nivelurile lor de bază între DBA și celelalte două tulpini de șoarece, B6 și FVB. Pentru a vizualiza diferențele de bază ale acestor șase genuri între cele trei tulpini de șoareci, boxplot-urile au fost reprezentate grafic folosind valorile transformate ale raportului centralizat (CLR) din conturile OTU cu pachetul „rgr” din software-ul R (24). Diferența dintre tulpini a fost evaluată folosind un ANOVA unidirecțional, urmat de testul post-hoc al lui Sidak. Deoarece Turicibacterul nu a fost distribuit în mod normal, diferența dintre tulpini a fost analizată prin testul Kruskal-Wallis urmat de testul lui Dunn.

Taxa care a diferit între fructoză și grupurile obișnuite de apă a fost identificată folosind testul T neparametric al lui White (27), urmat de estimarea ratei de descoperire falsă (FDR) a lui Storey utilizând date despre abundența relativă și analiza statistică a profilurilor metagenomice (28). Un ANOVA unidirecțional, urmat de testul post-hoc al lui Sidak, a fost utilizat pentru a determina diferența în raportul Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) între trei tulpini de șoarece. Raportul F/B a fost calculat prin împărțirea proporției Firmicutes și Bacteroidetes pentru fiecare probă și apoi transformat în log pentru a obține o distribuție normală.

Corelația dintre microbiota intestinală și fenotipurile metabolice sau genele semnăturii fructozei din țesuturile individuale a fost evaluată utilizând midcorelația Biweight (bicor) (29). Valorile statistice ale P-ului au fost ajustate folosind abordarea Benjamini-Hochberg și FDR B6 sau FVB) nu au fost nici ele corelate cu cantitatea de aport de apă din fructoză [FVB (23,6 ± 1,36 mL /) (mouse · d)> B6 (8,74 ± 0,187 ml /). (Șoarece · d) sau DBA (8,47 ± 0,390 ml/(șoarece · d)] (5). Cantitatea de aport a fost probabil determinată de diferențele de percepție și preferință a fructozei între tulpinile șoarecelui (6,30).

Efectele generale ale fructozei asupra comunității microbiotei intestinale

(A) Probele de microbiota Cecal pe trei tulpini de șoareci s-au arătat separate prin tulpină (A; n = 16/tulpină; săptămâna 12). (B-C) Probele de microbiota fecală pe trei tulpini de șoarece au fost separate atât de tulpină (B; n = 64/tulpină în 4 puncte de timp), cât și de timp (C; n = 16/punct de timp pentru fiecare tulpină). Graficul C a folosit aceeași ordonație ca graficul B, cu excepția coordonatei principale 3 (PC3) a fost prezentată ca axa x pentru a arăta relația cu timpul. (D-F) Pentru fiecare tulpină de șoarece, probele fecale au fost colorate în funcție de punctele de timp pentru B6 (D), DBA (E) și FVB (F) pentru a arăta efectul de timp. (G-I) Probele de fecale au fost colorate cu fructoză sau tratament cu apă pentru B6 (G), DBA (H) și FVB (I) pentru a arăta efectul tratamentului. Probele pentru perioada de timp de 12 săptămâni au fost prezentate în cercuri punctate, cu valorile P corespunzătoare pentru efectul tratamentului cu fructoză raportate. (J-L) Probele de cecal au fost colorate prin tratarea fructozei sau a apei pentru B6 (J), DBA (K) și FVB (L). Valorile P au fost generate de PERMANOVA, iar rezultatele semnificative au fost prezentate cu caractere aldine. Valorile P cu un asterisc indică faptul că s-au observat dispersii semnificativ diferite, care pot influența valorile P raportate deoarece PERMANOVA presupune o dispersie similară.

(A-B) Barele Taxa sunt reprezentate de microbiota de bază cecală (A) și fecală (B) a trei tulpini de șoareci la nivelul filumului. (C-H) Profiluri de bază ale abundenței pentru microbiota fecală specifică a trei tulpini de șoarece la nivelul genului. Valorile raportului de logare centrate (CLR) au fost utilizate pentru reprezentarea abundenței fiecărei microbiote. Parcele de cutii și mustăți de la minim la maxim care arată distribuția abundenței Lactobacillus (C), genul necunoscut al Clostridiales (D), genul necunoscut al Lachnospiraceae (E), genul necunoscut al S24-7 (F), Akkermansia (G) și Turicibacter (H). Linia centrală din casetă denotă valoarea mediană. ANOVA unidirecțională, urmată de testul post-hoc al lui Sidak, a fost efectuată pentru a calcula diferențele semnificative între trei tulpini de șoarece. Semnificațiile etichetate fără o literă comună diferă, P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up
  • Descărcați PowerPoint

Am corelat apoi abundența acestor impozite sensibile la fructoză cu fenotipurile metabolice din apă sau șoareci tratați cu fructoză. La șoarecii DBA, Erysipelotrichaceae cecale au fost corelate negativ cu adipozitatea și ASC (Figura suplimentară 4A, B). Rikenellaceae fecale la șoareci DBA au avut corelații negative cu greutatea corporală și adipozitate și o corelație pozitivă cu ASC în grupul cu fructoză, în timp ce nu s-a observat nicio corelație semnificativă cu aceste fenotipuri în grupul cu apă (Figura 3A-F). Nu a fost observată nicio corelație fenotipică pentru taxonii care răspund la fructoză la șoarecii B6 și FVB, ceea ce nu este surprinzător având în vedere modificările fenotipice mai slabe ale acestor tulpini de șoarece ca răspuns la consumul de fructoză.

Corelarea microbiotei receptive la fructoză cu gene semnate fructozei în țesuturile metabolice gazdă

Am analizat apoi corelația dintre abundența microbiotei responsive la fructoză și genele de semnătură ale fructozei gazdă în ficat, țesut adipos și hipotalamus (5). Am observat modele de corelație distincte în cele trei tulpini de șoareci: taxonii receptivi la fructoză B6 au fost corelați doar cu gene semnale de fructoză hipotalamică, în timp ce taxonii responsivi la fructoză din cecul sau fecalele DBA au fost corelate doar cu genele de semnătură ale ficatului sau țesutului adipos, respectiv ( rezumat în masa 2; lista completă a genelor corelate cu taxonii care răspund la fructoză în Tabelul suplimentar 1).

(A-C) Diagramele de corelație între proporția Rikenellaceae și greutatea corporală (A), adipozitatea (B) și ASC (C) de toleranță la glucoză între punctele de timp din grupul de apă. (D-F) Diagramele de corelație între proporția Rikenellaceae și greutatea corporală (D), adipozitatea (E) și ASC (F) ale toleranței la glucoză între punctele de timp din grupul fructozei. r = coeficientul de bi-corelație (bicor), P = valorile P ajustate de Benjamini-Hochberg. n = 7-8/grup/punct de timp.

În B6, Dehalobacterium a arătat o corelație pozitivă cu genele hipotalamice care codifică transportorul de neurotransmițător Slc6a3, o componentă de semnalizare crestată Nrarp și o genă autofagică Atg3. Akkermansia a fost corelată cu mai multe gene înrudite cu neurotransmițătorul, inclusiv precursorul codificării Oxt a oxitocinei/neurofizinei 1 și codificării Th a tirozinei hidroxilazei. În cecumul DBA, atât Anaerostipes cât și Clostridium au fost corelate pozitiv cu Cyp8b1 în ficat, care este responsabil pentru sinteza acidului biliar (34).

În fecalele DBA, toate impozitele sensibile la fructoză au fost corelate cu genele semnăturii gazdei ale țesutului adipos, iar aceste gene au fost implicate în metabolismul lipidic, sistemul imunitar, răspunsul la lipide, citokine și hormoni (Tabel suplimentar 2). Genele adipoase precum Abhd3, Msr1, Ccr1, Creb1 și Fas au fost corelate cu Rikenellaceae și Pseudomonadaceae, precum și genurile din aceste familii (Tabelul 2; Tabelul suplimentar 2). Luate împreună, aceste corelații sugerează că microbiota intestinală poate interacționa cu genele gazdă într-o manieră specifică de tulpină și țesut de șoarece ca răspuns la fructoză.

Alterarea microbiotei intestinale modulează răspunsul fructozei

Deoarece șoarecii B6 și DBA au prezentat răspunsuri metabolice disparate la fructoză, am testat dacă microbiota B6 conferă rezistență și microbota DBA conferă vulnerabilitate la efectele fructozei prin transplantarea fecalelor B6 la șoarecii DBA tratați cu antibiotice și invers (Figura 4A). Folosind secvențierea 16S rADN, am confirmat că microbiul intestinal al șoarecilor destinatari sa schimbat după transplantul de fecale (Figura suplimentară 5A, B).

(A) Proiectarea schematică a colonizării Akkermansia muciniphila (AM). PBS servește drept control pentru AM. (B-C) Creșterea în greutate corporală (B) și toleranța la glucoză (C) a șoarecilor primitori DBA cu sau fără apă de fructoză 8%. Datele sunt prezentate ca medii ± SEM, n = 8-14/grup. Valorile P ale factorilor principali (AM, fructoză, timp) și interacțiunile prin măsurători repetate în trei direcții ANOVA sunt prezentate în partea de sus a graficului. Asteriscurile indică momentele în care s-au găsit diferențe semnificative între grupurile de colonizare AM și controlul PBS sub tratament cu fructoză pe baza ANOVA cu măsuri repetate bidirecționale cu testul post-hoc al lui Sidak; * P xyang123ucla.edu

Abrevieri utilizate: AM, Akkermansia muciniphila; ASC, zona de sub curbă; B6, C57BL/6J; DBA, DBA/2J; FDR, rata de descoperire falsă; FMT, transplant de microbiote fecale; FVB, FVB/NJ; IPGTT, test de toleranță intraperitoneală la glucoză; PCoA, analiza coordonatelor principale; PERMANOVA, analiza variației permutaționale multivariate; TH, tirozin hidrogenaza