Informații despre articol

Această lucrare a fost susținută de un grant National Institutes of Health R21 EB004966-01 către J.X.C., Showalter Trust Award 1320046936, Departamentul Apărării acordă W81XWH-05-1-0473 și Purdue Cancer Center acordă ACS IRG 58-006-47 către I.G.C.

optică

Adresați solicitări de retipărire către: Ji-Xin Cheng, dr., Școala de inginerie biomedicală Weldon, 206 Intramural Drive, West Lafayette, IN 47907; e-mail: [e-mail protejat]. Ignacio G. Camarillo, dr., Departamentul de Științe Biologice, 915 West State Street, West Lafayette, IN 47907; e-mail: [e-mail protejat] .

Abstract

Obezitatea este un factor de risc stabilit pentru incidența și mortalitatea cancerului mamar. Cu toate acestea, mecanismul care leagă obezitatea de tumorigeneză nu este bine înțeles. Aici am combinat tehnologii de imagistică optică neliniară cu un model animal de cancer de sân obezitate indusă de dietă cu debut precoce, pentru a evalua impactul obezității asupra compoziției glandei mamare și a stromei tumorale. Folosind împrăștierea Raman coerentă anti-Stokes și a doua generație de armonici pe aceeași platformă, am imaginat simultan adipocite mamare, capilare sanguine, fibrile de colagen și celule tumorale fără nici o marcare. Am observat că obezitatea crește dimensiunea picăturilor lipidice de adipocite din glanda mamară și, respectiv, conținutul de colagen în stroma tumorală mamară, respectiv. Astfel de efecte ale obezității asupra glandei mamare și a stromei tumorale nu au putut fi analizate folosind evaluarea histologică bidimensională standard. Având în vedere importanța stromei mamare pentru creșterea și migrația celulelor tumorale, observația noastră oferă primele dovezi imagistice care susțin relația dintre obezitate și riscul de cancer mamar.

OBEZITATE este un factor de risc stabilit pentru o serie de boli umane, cum ar fi diabetul, bolile de inimă și cancerul de sân. 1,2 O creștere rapidă recentă a obezității la copii indică faptul că efectele adverse ale obezității asupra sănătății umane vor fi o preocupare majoră pentru viitorul apropiat. În special, riscul de cancer mamar crește semnificativ cu un indice de masă corporală crescut (> 30 kg/m 2). 2.3 În ciuda unei asociații bine stabilite, relația dintre obezitate și cancerul de sân nu este bine înțeleasă. O abordare obișnuită a studierii cancerului de sân este investigarea mutațiilor oncogenelor. 4 Cu toate acestea, procesul în care o celulă normală se transformă în cancer este condus nu numai de evenimente intrinseci celulare, cum ar fi mutațiile genetice, ci și de factorii extrinseci din micromediul. 5 Comportamentele fenotipice ale celulelor canceroase, cum ar fi proliferarea și invazia, sunt reglementate de componentele matricei extracelulare (ECM) și de factorii secretabili solubili ai celulelor stromale înconjurătoare. 5 –7 Interacțiunile dinamice ale celulelor canceroase și mediul local joacă roluri cruciale în supraviețuirea și dezvoltarea acestora în malignitate. 6.8 Întreruperea acestor interacțiuni a devenit în ultimii ani o strategie terapeutică viabilă pentru tratamentul cancerului. 9.10

Pentru a înțelege în continuare influența micromediului asupra tumorigenezei mamare, am folosit imagistica optică neliniară (OZN) pentru a caracteriza stroma glandei mamare și a țesuturilor tumorale. Deși studiile histologice permit analiza feliilor subțiri de biopsie tisulară, le lipsește informații tridimensionale cruciale pentru a descrie organizarea stromală în starea lor naturală. Pe de altă parte, microscopia OZN a demonstrat cu succes capacitatea de imagistică a țesuturilor profunde cu rezoluție tridimensională. 11 Utilizând a doua generație de armonici (SHG) și microscopie cu fluorescență de excitație cu doi fotoni (TPEF), o serie de grupuri de cercetare au imaginat colagen de tip I, celule tumorale care exprimă proteine ​​fluorescente verzi și vasculaturi marcate cu coloranți la animale vii. 12-16 Pentru moleculele care nu pot tolera etichetarea fluoroforului, microscopia coerentă anti-Stokes Raman scattering (CARS) oferă o tehnică de imagistică vibrațională extrem de sensibilă. 17 Recent, CARS a fost aplicat cu succes pe domeniile lipidice de imagine, membranele celulare, teaca axonală de mielină în țesuturile vii și adipocitele la animalele vii. 18–21 Aici combinăm microscopia CARS, SHG și TPEF într-o platformă multimodală pentru a imagina componentele stromei mamare, cum ar fi adipocitele, fibrilele de colagen, vasele de sânge și altele.

Mai exact, am întrebat cum obezitatea influențează compoziția glandei mamare și a stromei tumorale, ducând la relația observată între obezitate și riscul ridicat de cancer mamar. 3.22 Pentru a aborda această întrebare, am folosit un model de șobolan Sprague-Dawley de obezitate indusă de dietă cu debut precoce (DIO; vezi Metode; Figura S1 *). 23.24 Modele animale PART au fost utilizate pentru a studia multe boli asociate cu obezitatea. 25 Am plasat mai întâi un grup de șobolani tineri pe o dietă occidentală bogată în grăsimi pentru a induce obezitatea și un alt grup pe o dietă slabă de șobolan pentru a servi drept martori. Apoi am tratat un grup de șobolani cu metilnitrosourea (MNU), un cancerigen chimic care induce tumori mamare, iar celălalt grup de șobolani martor cu soluție salină. 26 La momente specificate (vezi Metode), am colectat glandele mamare și țesuturile tumorale pentru imagistica OZN (Figura S2). Pe baza imaginii CARS a adipocitelor și a imaginii SHG a fibrilelor de colagen, am observat că obezitatea crește dimensiunea picăturilor lipidice de adipocite din glanda mamară și conținutul de colagen în stroma tumorală mamară. Impactul obezității asupra adipogenezei și a conținutului de colagen ar trebui să contribuie la înțelegerea unui rol stabilit, dar nedefinit mecanic, al obezității asupra incidenței și mortalității cancerului mamar.

Materiale și metode

Model animal

Întreținerea țesuturilor

Glanda mamară și țesuturile tumorale au fost tăiate în bucăți mici de 2 × 2 × 2 mm și păstrate în Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) suplimentat cu 10% ser fetal bovin și 1% penicilină-streptomicină într-un incubator de 37 ° C cu 5% CO2. Țesuturile glandei mamare au fost realizate în 7 zile de la recoltare. Țesuturile tumorale mamare au fost fie păstrate în EMEM pentru imagistică în decurs de 24 de ore după colectarea țesutului, fie ținute congelate în azot lichid pentru imagistică ulterior (Figura S3).

Pregătirea histologiei

Glanda mamară și țesuturile tumorale au fost fixate într-o soluție de 10% formalină tamponată. După fixare, țesuturile au fost prelucrate și încorporate în blocuri de parafină. S-au preparat secțiuni de țesut cu o grosime de 5 μm și s-au colorat cu hematoxilină-eozină.

Imagistica optică neliniară

Starea imagistică

O cameră cu fund de sticlă care conține țesuturi scufundate în medii de întreținere a fost plasată la microscop pentru imagistica la temperatura camerei. Pentru imagistica CARS, puterea totală a laserelor Stokes și a pompei la probă a fost stabilită la 4 mW. Pentru imagistica SHG a țesuturilor proaspete și a secțiunilor de țesut histologic, puterea laserului a fost stabilită la 40 mW și respectiv 16 mW la 795 nm. Pentru imagistica TPEF, puterea laserului a fost setată la 16 mW la 795 nm.

Evaluarea conținutului de colagen stromal mamar

Un volum de analiză este definit cu dimensiunile de 250 μm (x) × 250 μm (y) × 40 μm (z), cu z = 0 fiind acoperișul și interfața țesutului (Figura S4). Pentru fiecare analiză de volum, au fost achiziționate 81 de cadre de-a lungul axei Z cu o dimensiune fixă ​​a treptei de 0,5 μm. Au fost evaluate nouă volume diferite și intensitatea totală a SHG (minus intensitatea fundalului) din 729 cadre (9 × 81 cadre) a fost utilizată pentru a deduce conținutul de colagen stromal mamar al fiecărui animal. Intensitatea de fond a fost colectată dintr-un volum de analiză lipsit de colagen. Puterea laserului la eșantion și tensiunea ridicată a PMT au fost menținute constante pentru toate măsurătorile.

Măsurarea diametrelor picăturilor lipidice ale adipocitelor

Adipocitele din țesuturile glandei mamare ale șobolanilor tratați cu ser fiziologic au fost scanate de-a lungul axei Z cu o dimensiune a pasului de 0,5 μm utilizând microscopia CARS. Au fost înregistrate cele mai mari valori măsurate ale diametrului picăturilor lipidice la secțiunile ecuatoriale. O sută de adipocite din stroma mamară a fiecărui șobolan au fost evaluate pentru a obține diametrul mediu al picăturii lipidice (Tabelul S1).

Rezultate

Figura 1. Imagistica optică neliniară a glandei mamare și a compoziției stromale tumorale. A, Adipocite și capilare sanguine (săgeți) imaginat cu împrăștiere coerentă anti-Stokes Raman (roșu) și fibrile de colagen imaginate cu a doua generație de armonici (SHG) (verde) într-o glandă mamară. B, Capilare sanguine și macrofage colorate cu izotocianat de fluorescenină conjugat izolectină B4 și fotografiate cu fluorescență de excitație cu doi fotoni (TPEF) (gri). Fibrilele de colagen au fost realizate cu SHG (verde). C, Adipocit (roșu) și fibrile de colagen (verde) organizare într-o glandă mamară. D-F, Organizarea celulelor tumorale (roșii) și a fibrilelor de colagenverde) de-a lungul axei verticale a unei strome tumorale mamare. Imagini realizate cu un obiectiv de imersiune în apă de 60 ×. Barele de scară = 25 μm.

Figura 2. Imaginare coerentă anti-Stokes Raman de împrăștiere a adipocitelor (roșu) și imagistica a doua generație de armonici a fibrilelor de colagen (verde) pentru a evalua impactul obezității asupra glandei mamare și a compoziției stromale tumorale. Imagini reprezentative (cadre unice) aleA) o glandă mamară a unui șobolan slab șobolan (LRC1),B-D) stromă tumorală mamară a trei șobolani slabi cu șobolan tumoral (LRCT1, LRCT2, LRCT3), (E) o glandă mamară a unui șobolan occidental obez (OW1) și (F-H) stroma tumorală mamară a trei șobolani tumorali occidentali obezi (OWT1, OWT2, OWT3). Imagini realizate cu un obiectiv de imersiune în apă de 60 ×. Barele de scară = 25 μm.

Figura 3. Analiza impactului obezității asupra glandei mamare și a compoziției stromale tumorale. Glanda mamară și țesuturile tumorale a trei șobolani din fiecare grupă de animale au fost analizate pentru conținutul de colagen și diametrul picăturilor de lipide (LD) ale adipocitelor. A, Intensitatea colagenului de a doua generație armonică totală (SHG) în glanda mamară și stroma tumorală. B, Diametrul mediu al LD ​​de 100 de glande adipocite în mamă. Barele de eroare reprezintă abaterile standard de la valorile medii.

Figura 4. Imaginea coerentă anti-Stokes Raman de împrăștiere a lipidelor (roșu) și imagistica a doua generație de armonici a fibrilelor de colagen (verde) a secțiunilor de țesut histologic standard. Histologia glandei mamare a (A) un șobolan slab șobolan (LRC), (B) un șobolan occidental obez (OW) și tumorile mamare ale (C) un șobolan tumoral slab chow (LRCT) șiD) un șobolan tumoral occidental obez (OWT). Imagini realizate cu un obiectiv de 20 × aer. Barele de scară = 75 μm.

Discuţie

Pe scurt, prin combinarea SHG, TPEF și CARS într-o singură platformă multimodală, am arătat avantajele unice ale imaginii OZN a cancerului mamar în țesuturile proaspete. În special, CARS și SHG ne-au permis să vizualizăm celulele tumorale și componentele semnificative ale stromei tumorale, cum ar fi capilarele sanguine, adipocitele și fibrilele de colagen, fără a fi nevoie de etichetare. Având în vedere capacitatea microscopiei multiphoton pentru imagistica animalelor vii, 12,13,15,21 este de conceput ca dezvoltarea tumorii mamare să poată fi imaginată în funcție de timp neinvaziv. Lucrările viitoare care corelează compoziția stromală a tumorii mamare și organizarea structurală cu evaluarea histologică a agresivității tumorii ar trebui să pună bazele utilizării imaginii OZN multimodale pentru a diagnostica fenotipul tumorii mamare.

Mulțumiri

Mulțumim lui Jonathan Sutcliff și Hongtao Chen pentru ajutor în experimentele imagistice și Han-Wei Wang pentru schema configurării experimentale. Mulțumim, de asemenea, Therese Salameh, Chris Gottfried și Julie Wilmowski pentru asistența lor în întreținerea animalelor și pregătirea țesuturilor.

*
Cifrele și tabelele identificate cu un „S” sunt suplimentare și pot fi vizualizate online numai de membri și abonați la .

*
Filmele suplimentare pot fi vizualizate online numai de către membri și abonați la .