ABSTRACT

Insulina, crescută în timpul obezității, reglează enzimele de biotransformare xenobiotică, potențial prin semnalizarea fosfatidilinozitol 3-kinazei (PI3K), în țesuturile extraovariene. PI3K reglează viabilitatea ovocitelor, activarea foliculară și biotransformarea chimică a ovarelor. 7,12-Dimetilbenz [a] antracen (DMBA), un agent cancerigen și ovotoxicant, distruge toate etapele foliculilor, ducând la insuficiență ovariană prematură. S-a raportat că obezitatea promovează tumorile induse de DMBA, dar rămâne necunoscut dacă obezitatea afectează metabolismul xenobiotic ovarian. Prin urmare, am investigat expresia ovariană a genelor metabolismului xenobiotic - epoxid microsomal hidrolază (Ephx1), glutation S-transferază (GST) clasa Pi (Gstp1) și clasa mu 1 (Gstm1) și membri de semnalizare PI3K [protein kinază B [AKT] alfa [Akt1], beta [Akt2] și factorul de transcripție a furcii subfamilia 3 [Foxo3]) - la șoareci femele slabi și obezi după expunere la DMBA (1 mg/kg; injecție intraperitoneală timp de 14 zile). În comparație cu șoarecii obezi slabi au scăzut (nivelurile de proteine ​​P Ser473/Thr308, GSTM1, GSTP1 și EPHX1. DMBA a scăzut (expresia proteinelor P Ser473 sau pAKT Thr308, FOXO3 și pFOXO3 Ser253. A existat un efect aditiv între obezitate și expunerea la DMBA pentru creșterea mRNA Gstm1 și Ephx1, precum și pentru exprimarea proteinelor GSTM1 și EPHX1.

ovotoxicității

INTRODUCERE

Obezitatea este corelată pozitiv cu o serie de pericole pentru sănătate, dintre care unele, inclusiv diabetul [1-5], bolile cardiovasculare [6-9] și cancerul [10-14], sunt principalele cauze ale decesului prevenibil. Prevalența obezității și a complicațiilor de sănătate legate de obezitate, cum ar fi diabetul de tip 2, care anterior erau considerate boli ale adulților, cresc acum și la copii [8, 15, 16], ducând la moarte prematură și infertilitate. În ultimii ani, a fost raportată o asociere puternică între creșterea indicelui de masă corporală cu o incidență crescută a afectărilor sănătății reproducerii [12, 17-20]. Femeile obeze au o probabilitate crescută de a prezenta semne de sindrom ovarian polichistic, fecunditate redusă și ovocite de calitate slabă [19, 21]. A existat, de asemenea, o legătură puternică între obezitate și un risc crescut de defecte congenitale, prematură și naștere mortală [22-28] și diabet gestațional [29, 30]. Deși există o asociere puternică între obezitate și sănătatea reproductivă compromisă, mecanismele moleculare implicate rămân prost definite. În plus, în ciuda prevalenței alarmante a obezității și a bolilor asociate obezității, se știe puțin despre modul în care această epidemie poate influența metabolismul xenobiotic ovarian.

Ovarele sunt importante pentru furnizarea celulei germinale necesare pentru perpetuarea speciilor și producerea de hormoni esențiali pentru creșterea și dezvoltarea femeilor [31-33]. La naștere, femelele se nasc cu un număr limitat de foliculi primordiali, care odată epuizați, nu mai pot fi alimentați [33 - 35]. Se acceptă faptul că procesul foliculogenezei este un proces ireversibil; odată ce foliculii sunt recrutați din bazinul de odihnă în bazinul în creștere, vor suferi atrezie dacă nu sunt selectați pentru creșterea ulterioară până la ovulație [36-38]. Spre deosebire de maturarea ciclică a foliculilor până la ovulație, activarea foliculară primordială inițială a fost identificată ca fiind reglată, independent de gonadotropinele hipofizare, în mare parte de factori ovarieni locali, inclusiv calea fosfatidilinozitol 3-kinazei (PI3K) [38-41]. Un echilibru între repaus, activare și atrezie a foliculilor primordiali este esențial pentru durata de viață reproductivă a femeilor [37, 38, 42]. Orice factor (i) de mediu care ar putea accelera rata activării foliculului primordial și procesul de atrezie ar amenința foarte mult potențialul reproductiv al femelei.

Obezitatea poate modifica sensibilitatea la insulină în mai multe țesuturi țintă, inclusiv mușchi, ficat, țesut adipos și ovar [2, 43-46]. Hormonul insulinei se leagă de receptorul său, rezultând autofosforilarea și recrutarea proteinelor substratului receptorului de insulină (Irs) [47-49], care la rândul său reglează numeroase căi de semnalizare mediate de insulină în aval, inclusiv semnalizarea PI3K [2, 43]. Evenimentele de semnalizare PI3K sunt mediate în mare parte prin protein kinaza B (AKT), o subfamilie formată din trei izoforme de mamifere Akt1, Akt2 și Akt3 [50]. După activarea PI3K, AKT este recrutat la membrană unde AKT este fosforilat (pAKT). AKT fosforilat se disociază de la membrană și navetează la nucleul celulei unde are capacitatea de a fosforila și de a inactiva mai multe ținte, inclusiv subfamilia 3 a factorului de transcripție a furcii (FOXO3).

O serie de substanțe chimice din mediu pot viza ovarul și distruge foliculii primordiali, precum și alte tipuri de foliculi, ducând la insuficiență ovariană prematură, infertilitate și alte tulburări de sănătate [31, 32, 51-53], făcând metabolismul xenobiotic ovarian critic pentru protecție a celulei germinale feminine. Hidrocarbura aromatică policiclică, 7,12-dimetilbenz [a] antracenă (DMBA), este un agent cancerigen de mediu [54-58], precum și un ovotoxicant [51, 52, 59, 60]. Expunerea umană la DMBA se datorează în principal fumului sau fumului provenit din arderea substanțelor organice, cum ar fi cărbunele, gazele de eșapament și fumul de țigară [59, 61]. În raport cu nefumătorii, femeile care fumează țigări suferă de debutul precoce al menopauzei și suferă de infertilitate [62 - 64]. Studiile efectuate pe modele animale au demonstrat că expunerea la DMBA poate distruge foliculii de toate tipurile, rezultând insuficiența ovariană prematură accelerată și alte complicații reproductive [32, 51, 59, 65, 66]. În ficat, compusul părinte DMBA este bioactivat la metabolitul său mai toxic, DMBA-3,4-diol-1,2-epoxid de izoformele 1B1 (CYP1B1) și 1A1 (CYP1A1) ale citocromului [59, 61, 67, 68] ] împreună cu epoxid hidrolază microsomală (EPHX1) [69, 70]. Mai multe studii au demonstrat, de asemenea, capacitatea ovarului de a metaboliza DMBA în metabolitul său mai ovotoxic, DMBA-3,4-diol-1,2-epoxid prin acțiunea EPHX1 [51, 59, 61, 68, 70-72].

Insulina poate regla expresia produselor genelor de biotransformare xenobiotică, cum ar fi CYP, glutation S-transferaze (GST) și EPHX1 prin semnalizarea PI3K/AKT [73, 74]. Inhibarea PI3K a fost, de asemenea, raportată pentru a modifica expresia genelor EPHX1, GSTP1 și GSTM1 în ovarele de șobolan cultivate în ziua 4 postnatală [75-77]. GSTP1 și GSTM1 sunt membri ai superfamiliei GST a proteinelor implicate în metabolismul fazei II a compușilor xenobiotici. Aceste enzime funcționează în detoxifierea compușilor electrofili, inclusiv agenți cancerigeni, medicamente terapeutice, toxine de mediu și produse de stres oxidativ, prin conjugare cu glutation [78]. Deși efectele obezității asupra ovotoxicității induse de DMBA nu au fost explorate anterior, a fost raportată reglarea EPHX1 de către insulină în țesuturile nonovariene [73, 74]. Deoarece obezitatea poate modifica acțiunea insulinei asupra țesuturilor sale țintă, inclusiv ovarul, am emis ipoteza că insulina crescută indusă de obezitate ar putea crește semnalizarea PI3K și ar putea modifica expresia genei xenobiotice ducând la o ovotoxicitate accelerată indusă de DMBA.

MATERIALE ȘI METODE

Reactivi

Animale

Șoareci nonagouti normali de sex sălbatic de patru săptămâni (a/a; slăbiți desemnați; n = 15) și șoareci galbeni letali agouti (KK.Cg-Ay/J; obezi desemnați; n = 15) au fost obținuți de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME) și găzduit la unitatea de animale de la Universitatea de Stat din Iowa. Toate protocoalele și procedurile experimentale au fost aprobate de Comitetul de îngrijire a animalelor din Universitatea de Stat din Iowa (IACUC). Animalele au fost întreținute în condiții de iluminare controlată (12L: 12D) și temperatură (21 ° C - 22 ° C). Hrana și apa au fost furnizate ad libitum. La vârsta de 6 săptămâni, șoareci galbeni letali nonagouti și agouti (n = 5/genotip) au fost uciși. La vârsta de 18 săptămâni, testarea toleranței la glucoză a confirmat faptul că șoarecii obezi erau mai puțin toleranți la glucoză decât colegii lor slabi și aveau un nivel sistemic mai ridicat de glucoză bazală. Atât șoarecii slabi, cât și cei obezi (n = 10/genotip) au fost intraperitoneal (i.p.) dozați cu ulei de susan sau DMBA (> 98%; 1 mg/kg/zi) timp de 14 zile. Această doză a fost aleasă pe baza distrugerii a aproximativ 50% din foliculii primari și secundari, cu o pierdere mai mare de foliculi primordiali [52].

Colecția de țesuturi

Șoarecii au fost uciși la vârsta de 6 săptămâni sau la 3 zile de la sfârșitul dozei (aproximativ 20 de săptămâni) în timpul etapei de ciclism proestrus, iar greutatea corporală a fost înregistrată. Ovarele au fost colectate, tăiate cu exces de grăsime și cântărite. Un ovar a fost fixat în paraformaldehidă cu 4% pentru analiză histologică, în timp ce celălalt ovar a fost depozitat în ARN mai târziu la -80 ° C pentru studii de expresie a ARN și proteine.

Histologie și numărare a foliculilor

Lucrarea de histologie a fost efectuată la laboratorul de histopatologie al Universității de Stat din Iowa, Medicină Veterinară. Pe scurt, un ovar de la fiecare animal a fost fixat în paraformaldehidă 4% peste noapte, transferat la 70% etanol, deshidratat, încorporat în blocuri de parafină, secționat în serie (5 μM) și fiecare a șasea secțiune (4-6 secțiuni/lamă) a fost montată –20 diapozitive pe animal) și colorate cu hematoxilină și eozină. Imaginile digitale au fost achiziționate cu un microscop fluorescent Leica DMI300B. Numărul de foliculi sănătoși (foliculi care conțin ovocite care prezintă un nucleu distinct de ovocite) au fost clasificați și numărați în fiecare secțiune a 12-a conform procedurilor descrise anterior [79, 80]. Pe scurt, foliculii primordiali conțineau un ovocit înconjurat de un singur strat de celule granuloase în formă de scuamoase, foliculii primari conțineau un ovocit înconjurat de un singur strat de celule granuloase în formă cuboidală, foliculii secundari conțineau un ovocit înconjurat de mai multe straturi de celule granuloase și foliculii antrali conțineau un ovocit înconjurat de cel puțin două straturi de celule granuloase și un spațiu antral plin de lichid.

Izolarea ARN-ului

ARN-ul total a fost izolat folosind Qiagen RNeasy Mini Kit (n = 3 ovare per tratament) conform protocolului producătorului. Pe scurt, ovarele au fost lizate și omogenizate folosind un omogenizator portabil, urmat de aplicarea omogenatului pe o coloană QIAshredder cu centrifugare ulterioară la 16 100 forță centrifugă relativă timp de 2 minute la temperatura camerei. Supernatantul rezultat a fost aplicat pe o coloană RNeasy Mini, permițând ARN-ului să se lege de cartușul de filtrare. După spălare, ARN-ul a fost eluat din filtru și concentrat folosind un kit RNeasy MinElute conform protocolului producătorului. ARN-ul total concentrat final a fost eluat folosind 14 pl de apă fără RNază, iar concentrația de ARN a fost determinată folosind un spectrofotometru ND-1000 (λ = 260/280 nm; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE).

Sinteza ADNc pe prima catenă și reacția în lanț cantitativă în timp real a polimerazei

Izolarea proteinelor și analiza Western Blot

Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate folosind fie ANOVA bidirecțională, urmată de comparații multiple Bonferroni pentru a evalua interacțiunea dintre tulpină și medicament, fie ANOVA unidirecțională, urmată de funcția de comparație multiplă Tukey a software-ului GraphPad Prism 5.5 cu un nivel de semnificație statistic stabilit la P Fig. 1). Nu a existat niciun efect al DMBA asupra greutății corporale (Fig. 1 A); cu toate acestea, comparativ cu uleiul de susan, DMBA a scăzut greutatea ovariană în ambele slabe (P Fig. 1 B). Nu a existat nicio diferență între greutatea ovariană a grupurilor tratate cu susan slab și obez; cu toate acestea, tratamentul cu DMBA a fost redus în continuare (P Fig. 1 B). Atât la femeile slabe, cât și la cele obeze, tratamentul cu DMBA a scăzut semnificativ (P Fig. 1 C - F). În mod interesant, ovarele de la șoareci obezi au scăzut atât foliculii (P Fig. 1 C), cât și foliculii primari (Fig. 1 D), dar au crescut (P Fig. 1 E) și foliculii preovulatori (Fig. 1 F) comparativ cu ovarele din susan slab. șoareci tratați. Nu s-a observat niciun impact al obezității sau DMBA asupra numărului de corpuri lutea.