• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

REZUMAT

Feroptoza este o formă dependentă de fier a morții celulare reglementate asociată cu fosfolipide polinesaturate oxidate. Înțelegerea rolului acestui proces in vivo a fost încetinită de lipsa sistemelor model ușor accesibile. Expunerea nematodului Caenorhabditis elegans la acidul dihomogamma-linolenic al acidului gras polinesaturat (DGLA; 20: 3n-6) determină moartea celulelor germinale și sterilitatea care este în mare măsură independentă de calea apoptozei canonice. Aici demonstrăm că moartea celulelor germinale indusă de DGLA este modulată de inhibitori ai feroptozei cu molecule mici, manipulare genetică a feritinei, NADPH oxidazei și glutation peroxidazelor și prin co-suplimentarea dietei cu acid oleic. Astfel, moartea celulelor germinale indusă de DGLA la C. elegans este foarte similară cu feroptoza din celulele mamiferelor. DGLA poate induce, de asemenea, feroptoza în celulele umane, subliniind în continuare acest PUFA omega-6 ca instigator metabolic al feroptozei. Împreună, aceste rezultate stabilesc C. elegans ca un model animal puternic pentru a studia inducerea și modularea feroptozei de către grăsimile dietetice.

feroptozei

Repere

- Moartea celulelor germinale indusă de acidul dihomogamma-linolenic (DGLA) în C. elegans este ameliorată de antioxidanți cu molecule mici și chelatori de fier

- Acidul oleic dietetic și endogen protejează împotriva feroptozei induse de DGLA

- Deficitul de eter-lipide crește sensibilitatea la feroptoza indusă de DGLA

- DGLA induce în mod specific feroptoza în celulele canceroase umane

INTRODUCERE

Acizii grași polinesaturați cu lanț lung (PUFA) sunt esențiali în dieta oamenilor, deși există încă dezbateri cu privire la cantitățile optime de diferite specii de grăsimi dietetice (Mukhopadhyay, 2012). PUFA-urile sunt clasificate ca omega-6 (n-6) sau omega-3 (n-3), în funcție de poziția legăturii duble terminale din moleculă. Acizii grași omega-6 sunt precursori ai moleculelor puternice de semnalizare, cum ar fi prostaglandinele și leucotrienele care promovează răspunsurile inflamatorii. Aceste răspunsuri sunt importante pentru combaterea agenților patogeni și pentru reproducerea normală, dar excesul de acizi grași omega-6 este asociat cu stări de boală, cum ar fi bolile cardiovasculare și cancerul (Harris și colab., 2009).

Ferroptoza, o formă dependentă de fier a morții celulare neapoptotice reglate, este definită de trei caracteristici conservate - prezența acizilor grași polinesaturați oxidați (PUFA), disponibilitatea fierului redox activ și repararea defectuoasă sau inhibată a peroxidului lipidic (Dixon și Stockwell, 2019). Ferroptoza a fost demonstrată în mai multe sisteme de mamifere, inclusiv diverse linii celulare de cancer (Dixon și colab., 2012; Dixon și colab., 2014), șoareci mutanți inductibili Gpx4 -/- (Friedmann Angeli și colab., 2014; Ingold și colab., 2018), felii de hipocamp de șobolan și culturi de oligodendrocite (Dixon și colab., 2012; Skouta și colab., 2014). În celulele de mamifere, feroptoza poate fi suprimată de chelatori de fier cu molecule mici și antioxidanți de captare a radicalilor (Stockwell și colab., 2017). Relevanța fiziologică și reglarea feroptozei este în prezent un subiect de mare interes, dar influența dietei asupra feroptozei nu a fost examinată. Progresele cu privire la această problemă și la alte probleme conexe au fost împiedicate de absența modelelor animale accesibile și ușor de manipulat ale procesului feroptotic.

Nematodul Caenorhabditis elegans (C. elegans) este un model puternic pentru investigarea importanței acizilor grași din dietă în dezvoltarea și menținerea liniei germinale. Această specie sintetizează o gamă largă de acizi grași (Hutzell și Krusberg, 1982; Watts și Browse, 2002) și crește și se reproduce pe o gamă largă de temperaturi. Reproducerea este un proces intensiv din punct de vedere energetic, în care la vârful depunerii de ouă un hermafrodit adult convertește zilnic echivalentul întregii sale mase corporale în ouă (Hirsh și colab., 1976). Grăsimile dietetice sunt o sursă importantă de lipide pentru producția de ouă de C. elegans, iar acizii grași din organism se transformă la fiecare 24 de ore (Dancy și colab., 2015).

Anterior, am descoperit că C. elegans cultivat în prezența acidului gras polinesaturat acid dihomogamma-linolenic (DGLA, 20: 3n-6) a devenit steril (Watts și Browse, 2006). Hermafroditele de tip sălbatic crescute pe DGLA sunt grav deficitare în producția de celule germinale, iar expunerea la niveluri mai scăzute de DGLA care nu a cauzat sterilitate de 100% în populație a condus totuși la un număr redus de celule germinale, spermă și descendenți (Watts și Browse 2006). Căile genetice care reglementează răspunsurile la stres oxidativ, homeostazia lipidică și durata de viață au modulat sensibilitatea la DGLA dietetic (Watts și Browse, 2006; Webster și colab., 2013), la fel ca și manipularea enzimelor de oxidare PUFA (Deline și colab., 2015).

În acest studiu am testat ipoteza că moartea celulelor germinale induse de DGLA în dietă are loc prin feroptoză. Folosind abordări biologice chimice, genetice și lipidomice, raportăm că fierul, speciile reactive de oxigen (ROS) și metabolismul lipidelor modulează efectele DGLA dietetice asupra sistemului reproductiv al viermilor. Mai mult, suplimentarea DGLA este suficientă pentru a induce feroptoza în celulele canceroase umane, demonstrând posibilitatea feroptozei mediată de dietă între specii.

REZULTATE

DGLA dietetic declanșează moartea celulelor germinale feroptotice

DGLA dietetic este un puternic inductor al morții celulelor germinale la C. elegans, cu dovezi genetice care sugerează că acest lucru ar putea fi parțial un proces oxidativ (Deline și colab., 2015; Watts și Browse, 2006; Webster și colab., 2013). Pentru a testa dacă acest proces a implicat feroptoză, am tratat animalele de tip sălbatic cu DGLA dietetică și antioxidantul feroptoză lipofilică specifică care captează antioxidantul ferostatin-1 (Fer-1) (Dixon și colab., 2012; Zilka și colab., 2017 ). În mod surprinzător, la animalele tratate împreună cu DGLA și Fer-1, atât moartea celulelor germinale, cât și sterilitatea au fost reduse comparativ cu viermii tratați numai cu DGLA (Figura 1A). Fer-1 singur nu a avut niciun efect de fertilitate. Nu numai că au existat mai mulți viermi fertili în grupul de tratament DGLA + Fer-1 comparativ cu DGLA singur, dar numărul de viermi fertili cu dezvoltare normală a gonadelor, așa cum a fost testat prin colorarea DAPI, a fost crescut comparativ cu grupul martor (Figurile 1B, C ).

(A) Procent (%) sterilitate a viermilor de tip sălbatic hrăniți combinațiile indicate de acid oleic (OA) și DGLA. Graficele arată procentul mediu de sterilitate la cinci populații de 50 de viermi expuși la diferite concentrații de DGLA și OA. Asteriscurile prezintă semnificație P N). Acest lucru ne-a permis să monitorizăm moartea celulară utilizând analiza scalabilă în timp a abordării cineticii morții celulare (STACK) (Forcina și colab., 2017). La fel ca un inductor de feroptoză cu molecule mici de control pozitiv, erastin2, DGLA exogen (500 μM) a fost capabil să declanșeze moartea celulelor sensibile la ferostatină-1 în decurs de 24 de ore (Figura 3A, B). La aceeași concentrație, AA exogenă a indus moartea celulară, dar aceasta nu a fost în mod eficient suprimată în timp prin co-tratament cu Fer-1, indicând că la această doză AA exogenă poate contribui la alte moduri de moarte celulară (Figura 3A). La doze mai mici (250 μM și mai mici), atât DGLA cât și AA au prezentat o letalitate redusă în celulele HT-1080 N (Figura 3A). Astfel, PUFA exogene omega-6 sunt suficiente pentru a declanșa feroptoza ca agenți unici în celulele canceroase umane într-o manieră specifică structurii.

(A) Moartea celulară (fracția letală) în timp în celulele HT-1080 N tratate ± erastin2, DGLA sau acid arahidonic (AA) și ± Fer-1 (1 μM). (B) Imagini reprezentative care prezintă un câmp de celule HT-1080 N tratate ± DGLA (500 μM) ± ferostatină-1 (Fer-1, 1 μM). Celulele vii exprimă mKate2 localizat nuclear; celulele moarte preiau SYTOX Green. Imaginile au fost achiziționate la 72 h post-tratament. (C) Imagini confocale ale C11 BODIPY 581/591 (aici „C11”) în celule HT-1080. După tratament timp de 8 ore, celulele au fost marcate cu C11 (5 μM) și Hoechst (1 μg/ml) înainte de imagistică. C11 Ox: C11 oxidat; C11 Non-Ox: C11 neoxidat. Bară de scară = 20 μm. (D) Harta de căldură care arată modificările relative ale pliurilor în compoziția acizilor grași din diferite clase de lipide după 6 ore de creștere cu DGLA (500 μM sau 250 μM) comparativ cu etanol. PC: fosfatidilcolină, PE: fosfatidiletanolamină, neutru: lipide neutre. Căsuțele gri indică situații cu concentrații de acizi grași mai mici de 0,4%. Datele reprezintă valorile medii din trei experimente independente.

DISCUŢIE

Aici raportăm că feroptoza poate fi indusă în celulele germinale ale C. elegans expuse la acidul gras polinesaturat DGLA. Acest fenotip letal este promovat de activitatea NOX și fier și este opus de ortologii vierme GPX4 și antioxidanți. În aceste privințe, procesul observat în celulele germinale ale C. elegans este foarte analog cu feroptoza din celulele de mamifere (Tabelul 1 și referințe în acesta). Specificitatea feroptozei induse de DGLA pentru celulele germinale ale animalelor tinere este de mare interes. Lipidele dietetice pot fi concentrate preferențial în aceste celule în timpul procesului rapid și exigent de metabolizare a formării celulare care are loc în gonadele sincițiale. O altă posibilitate este că linia germinală în sine poate fi deficitară în apărarea antioxidantă (sau îmbogățită în enzime prooxidante) care fac aceste celule hipersensibile la acumularea de peroxizi lipidici în comparație cu celulele somatice. Interesant este că feroptoza poate apărea și în celulele intestinale ale C. elegans în vârstă (Jenkins, BioRxiv 2019). Aici, procesul de îmbătrânire în sine poate duce la pierderea controlului asupra homeostaziei fierului sau a altor procese care în mod normal împiedică feroptoza în țesuturile somatice. Împreună, aceste rezultate stabilesc C. elegans ca un model animal puternic și tractabil genetic al feroptozei.

CONTRIBUȚIILE AUTORULUI

Conceptualizare: J.L.W. și S.J.D. Metodologie și investigație: M.A.P, L.M.; Scrierea, editarea și revizuirea: M.A.P., L.M., S.J.D., J.L.W.; Achiziție și supraveghere de finanțare: J.L.W. și S.J.D.

DECALAREA INTERESELOR

S.J.D. este membru al consiliului consultativ științific al Ferro Therapeutics.

Proceduri experimentale suplimentare

Contactați pentru partajarea reactivilor și a resurselor

Informații suplimentare și cereri de resurse și reactivi ar trebui să fie direcționate către și vor fi îndeplinite de către contactul principal, Jennifer Watts (jwattswsu.edu).

MODEL EXPERIMENTAL ȘI DETALII OBIECTIVE

C. elegans tulpini și întreținere

Stocurile de nematode au fost menținute pe plăcile mediului de creștere a nematodelor (NGM) însămânțate cu bacterii (E. coli OP50) la 20 ° C. Următoarele tulpini/alele utilizate în acest studiu au fost obținute de la Centrul Genetic Caenorhabditis (CGC): N2 Bristol (de tip sălbatic), CB767 bli-3 (e767), MT1522 ced-3 (n717). Tulpina GA912 ftn-1 (ok3625) a fost un cadou de la Dr. David Gems (University College London, Londra, Marea Britanie). Tulpina OB266 bli-3 (im10) a fost un cadou de la Dr. Danielle Garsin (Universitatea din Texas Health Science Center, Houston, Texas, SUA).

Linii celulare și substanțe chimice

Celulele HT-1080 (Cat # ATCC CCL-121) au fost achiziționate de la ATCC, extinse pentru un singur pasaj, alicotate și înghețate la -140 ° C până la utilizare. Celulele HT-1080 N (sex: masculin) au fost descrise anterior (Forcina și colab., 2017). Erastin2 (compusul 35MEW28 din (Dixon și colab., 2014)) a fost sintetizat de Acme Bioscience (Palo Alto, CA). Dimetil sulfoxid (DMSO, Cat # 276855) și ferostatin-1 (Cat # SML0583) au fost de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Etanolul (Cat # AX0441-3) a fost de la EMD Millipore (Billerica, MA). Acidul dihomo-γ-linolenic (DGLA, Cat # 90230) provenea din Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). SYTOX Green (Cat # S7020) provenea de la Molecular Probes (Eugene, OR). Toți compușii au fost depozitați la -20 ° C.

DETALII METODE

Suplimentarea cu acizi grași pentru analiza sterilității C. elegans

Mediul suplimentat cu acid gras a fost descris anterior (Deline și colab., 2013). Pentru mediile NGM, 0,1% Tergitol NP40 (Sigma Chemicals Cat # NP40S) și sarea de sodiu a acidului dihomo-gamma-linolenic (DGLA, 20: 3n-6) (NuChek Prep, Inc. Cat # S-1143) sau acid oleic (OA, 18: 1n-9) (NuChek Prep, Inc. Cat # S-1120) au fost adăugate la diferite concentrații variind de la 0,1 mM la 0,3 mM DGLA. Sursa de hrană OP50 E. coli au fost plăci însămânțate cu 3 zile înainte de placare larvele sincronizate C. elegans L1. Viermii adulți au fost evaluați pentru sterilitate la 72-96 de ore, unde sterilitatea a fost determinată prin punctarea viermilor cu absențe de embrioni, după cum se indică printr-un uter gol cu ​​microscopie ușoară. Testele de sterilitate au fost punctate și mediate pe cinci plăci individuale din fiecare genotip, fiecare constând din 50 de nematode. Sterilitatea a fost comparată între populațiile martor și populațiile experimentale utilizând testul t al unui student cu două cozi. Absorbția exogenă a nematodelor de acid gras a fost confirmată prin transesterificarea directă a populațiilor de nematode folosind 2,5% H2SO4 timp de o oră la 70 ° C pentru a genera ester metilic al acidului gras (FAME). FAMES au fost extrase cu hexan pentru analiza cromatografiei de gaze/spectrometrie de masă (GC/MS) (Watts și Browse, 2002).

Suplimentarea cu ferostatină-1 și DGLA

Plăcile DGLA au fost realizate din timp prin adăugarea de diferite concentrații la agar NGM topit înainte de placare. OP50 a fost placat și lăsat să se usuce timp de două zile înainte de placarea drogurilor și a viermilor. Ferostatina-1 (Fer-1) (Sigma-Aldrich Cat # SML0583) a fost dizolvată în dimetil sulfoxid (DMSO, Cat # 276855) și diluată la concentrațiile corespunzătoare în 10% DMSO înainte de a fi plasată pe sursa alimentară OP50 în scurt timp. Soluția Fer-1 sau controlul DMSO a fost lăsat să se absoarbă în plăci timp de 20-30 de minute înainte de a adăuga nematode în stadiul L1.

Suplimentarea cu Trolox și 2,2’-bipiridină (BP) DGLA

2,2-bipiridil (BP) (Sigma-Aldrich Cat # D216305) (75μm) sau Trolox (Cayman Chemicals Cat # 10011659) au fost adăugate direct la agar NGM. Fie medicamentul, fie volumul echivalent de vehicul, DMSO, au fost adăugate la topit împreună cu diferite concentrații de DGLA în agar NGM înainte de turnarea în plăci.

Interferența mediată de ARN (ARNi) a genelor glutation peroxidazei pe DGLA

ARNi prin hrănirea cu plăci suplimentate DGLA a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (Deline și colab., 2013). E. coli HT115 care exprimă controlul vectorului L4440 gol sau clonele gpx RNAi au fost obținute din Biblioteca Ahringer (Source Biosource) și verificate prin secvențiere (Kamath și colab., 2003).

Colorarea DAPI pentru vizualizarea celulelor germinale

Pentru a vizualiza celulele germinale după hrănire (fie DGLA/DMSO, DGLA/250μM Fer-1, fie DGLA/1mM Trolox) viermii au fost spălați cu 1 ml de tampon M9 și distribuiți pe un pahar de ceas. Majoritatea tamponului M9 a fost șters, iar viermii au fost apoi fixați și colorați cu etanol conținând 0,2μg/ml 2 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Fisher Scientific, Cat # D1306) și lăsat să se fixeze și pata timp de 10 minute. Viermii au fost așezați pe o lamă de acoperire cu o picătură de apă și aderați la o lamelă care conține 2% agar. Imaginile au fost achiziționate cu ajutorul unui microscop Olympus BX53 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japonia) cu un obiectiv obiectiv 10X.

Experimente de moarte cu celule de mamifere

Cu o zi înainte de experiment, 5.000 de celule HT-1080 N/godeu au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri (Cat # 3904, Corning). A doua zi, mediul de cultură celulară a fost înlocuit cu DMSO (vehicul) sau Fer-1 (1 μM) și etanol (vehicul) sau DGLA (de 2 ori, seria de răspuns la doză de 10 puncte, începând de la 500 μM). SYTOX Green (20 nM) a fost inclus în toate godeurile. Tratamentul cu Erastin2 (1 μM) a fost un control pozitiv pentru inhibarea feroptozei dependentă de ferostatin-1. Celulele au fost fotografiate pe Essen IncuCyte Zoom (Ann Arbor, MI) și analizate așa cum este descris (Forcina și colab., 2017). Au fost efectuate trei experimente biologice independente pentru fiecare afecțiune.

C11 581/591 imagistica BODIPY

Cu o zi înainte de experiment, 125.000 de celule HT-1080/godeu au fost însămânțate în plăci cu 6 godeuri (Cat # 3516, Corning) cu un 22 mm 2 nr. 1,5 sticlă de acoperire din fiecare godeu. A doua zi, celulele au fost tratate cu vehicul (etanol) sau DGLA (500 μM) și DMSO sau ferostatină-1 (1 μM) în mediu de creștere HT-1080 la 37 ° C timp de 8 ore. După 8 ore, mediul a fost îndepărtat și celulele au fost tratate cu C11 BODIPY 581/591 (Cat # D3861, Molecular Probes, Eugene, OR; concentrație finală = 5 μM) și Hoechst (Cat # H1399, Molecular Probes; concentrație finală = 1 μg/ml) dizolvat în HBSS și incubat la 37 ° C timp de 10 min. După 10 min, amestecul C11 BODIPY 581/591/Hoechst a fost îndepărtat și HBSS proaspăt a fost adăugat la celule. Fiecare alunecare de acoperire a fost îndepărtată și montată în 25 μL HBSS pe o lamă de microscop de sticlă. Celulele au fost realizate cu ajutorul unui microscop Zeiss Axio Observer cu un cap de disc rotativ confocal (Yokogawa, Tokyo, Japonia), obiectivul de imersie în ulei PlanApoChromat 63 ×/1.4 NA și o cameră CCD Cascade II: 512 cu multiplicare a electronilor (EM), Tucson, AZ). Imaginile au fost procesate în ImageJ 1.48v. Imagistica a fost efectuată pe două replici biologice independente pe condiție de tratament.

Analiza lipidelor celulare de mamifere