Abstract

fundal

Prevalența supraponderalității crește la câini, dar evenimentele metabolice legate de această afecțiune sunt încă puțin înțelese. Scopul studiului a fost de a investiga răspunsul postprandial al metaboliților plasmatici utilizând un test de provocare a mesei și de a identifica variațiile metabolice legate de supraponderabilitatea spontană la câinii cu proprietate privată.

Rezultate

Au fost incluși douăzeci și opt de câini sănătoși Labrador Retriever de sex masculin, 12 dintre aceștia fiind clasificați ca slabi (scorul stării corpului (BCS) 4-5 pe o scară de 9 puncte) și 16 ca supraponderali (BCS 6-8). După un post peste noapte (14-17 ore), s-au recoltat probe de sânge, iar câinii au fost acolo după o masă bogată în grăsimi. Probele de sânge postprandiale au fost recoltate de patru ori pe oră. Metaboliții plasmatici au fost identificați prin rezonanță magnetică nucleară. Metabolomii postprandiali au diferit de metabolomul de post în analiza discriminantă multivariată (PLS-DA: Q 2 Y = 0,31-0,63, ANOVA validată încrucișat: P ≤ 0,00014) Unsprezece metaboliți, toți aminoacizii, au contribuit la separări. Carnitina a fost identificată ca un metabolit legat de supraponderalitate (analiza de regresie logistică treptată P ≤ 0,03), iar câinii supraponderali au avut în general un răspuns mai mic al carnitinei (model mixt analiză măsuri repetate P = 0,005) decât câinii slabi. În special, concentrația medie de carnitină la post la câinii supraponderali (9,4 ± 4,2 µM) a fost aproape de limita de referință propusă pentru insuficiența de carnitină.

Concluzii

A fost detectat un răspuns postprandial de aminoacizi, dar nu s-au găsit variații dependente de timp în ceea ce privește grupurile de condiții corporale. Concentrații mai mici de carnitină s-au găsit la supraponderali comparativ cu câinii slabi. Această ultimă constatare ar putea indica o insuficiență de carnitină legată de adipozitatea spontană și de alterarea metabolismului lipidic la câinii supraponderali din această cohortă de Labrador Retriever.

fundal

Obezitatea este o tulburare complexă și a devenit una dintre preocupările majore de sănătate la câini, precum și la oameni [1,2,3,4]. Gestionarea greutății la câini este o provocare atât pentru proprietari, cât și pentru medicii veterinari. Terapiile actuale pentru câinii supraponderali se concentrează în principal pe restricționarea energiei, care nu are întotdeauna succes [5, 6]. În consecință, un număr mare de câini suferă de supraponderalitate cronică și prezintă un risc crescut de calitate slabă a vieții, debut precoce al bolilor cronice și o durată de viață scurtată [7,8,9].

La câini, ca și la oameni, supraponderalitatea poate duce la tulburări metabolice, de ex. rezistența la insulină și hiperlipidemia [10,11,12,13]. În ciuda prevalenței crescânde a obezității în rândul câinilor, mecanismele moleculare asociate cu această afecțiune nu sunt încă pe deplin înțelese. Rezonanța magnetică nucleară (RMN) este un instrument puternic și utilizat pe scară largă pentru identificarea modificărilor moleculare în diferite condiții [14]. Tehnica RMN permite identificarea și cuantificarea unei varietăți de metaboliți (în principal amine mici și acizi organici) și ar putea oferi noi perspective asupra metabolismului în sănătate și boală. Studii recente de metabolomică au arătat că oamenii supraponderali au adesea concentrații crescute de acilcarnitine plasmatice [15,16,17] și aminoacizi cu lanț ramificat [18, 19] și că câinii supraalimentați ar putea prezenta un model bifazic al diferiților metaboliți plasmatici, adică o creștere în timpul creșterii acute în greutate și, mai târziu, o normalizare a supraponderalității cronice [20]. Tehnica RMN are potențialul de a identifica variațiile metabolice între câinii slabi și cei supraponderali, dar nu a fost utilizată pe scară largă pentru a studia metaboliții plasmatici la câinii spontan supraponderali.

În cele câteva studii care investighează metabolomii plasmatici la jeun la câini, metabolomul la jeun s-a dovedit a varia în funcție de variațiile individuale și dieta [20,21,22], iar câinii supraponderali prezintă variații ale metaboliților legați de metabolismul lipidelor [23, 24]. La om, metabolomul postprandial este mai puțin variabil decât postul și poate genera mai multe informații despre schimbări metabolice importante care altfel ar fi greu de detectat [25,26,27,28,29]. La câinii supraponderali, am constatat anterior variații metabolice mai pronunțate în postprandial comparativ cu urina de post [30]. Prin urmare, metabolomica plasmatică în combinație cu o provocare de masă are potențialul de a îmbunătăți înțelegerea metabolismului canin și de a detecta variații metabolice subtile legate de supraponderabilitatea la câini. Din câte știm, metabolomul plasmatic al câinilor slabi și supraponderali spontan, dar altfel sănătoși, în timpul unui test de provocare a mesei nu a fost publicat anterior. Prin urmare, scopul studiului a fost de a investiga metaboliții plasmatici postprandiali la Labrador Retriever sănătoși slabi și supraponderali utilizând un test de provocare a mesei și de a identifica variațiile metabolice legate de supraponderabilitatea spontană.

Metode

Animale

Proiectarea studiului general

Evaluarea stării de sănătate și a stării corpului

Fiecare câine a fost supus unei examinări fizice standard (evaluarea stării generale, a stării pielii, a temperaturii rectale, a membranelor mucusului vizibile, a ganglionilor limfatici palpabili, auscultării inimii și plămânilor, palparea abdominală și mersul). Câinii au fost cântăriți și fotografiați. S-au efectuat analize de rutină de hematologie și biochimie serică (alanină aminotransferază, fosfatază alcalină, acizi biliari de post, creatinină, uree, glucoză, fructozamină, proteină totală, albumină, proteină C reactivă, tiroxină totală, hormon stimulator tiroidian, sodiu, potasiu și clorură) pe probe de sânge în post. Urina a fost analizată printr-un test standard de chimie a jojei și prin refractometrie. Unele probleme minore de sănătate (mers ușor rigid și șchiopătură ușoară, parodontită ușoară, formare palpabilă de osteofite peri-articulare și furunculoză cutanată) au fost detectate la 11 câini. Niciunul dintre acești câini nu a fost exclus, deoarece parametrii vitali, hematologia, biochimia serică și analiza urinei au fost în limitele de referință pentru câinii sănătoși.

Câinilor li s-a atribuit un scor al stării clinice a corpului (BCS) în conformitate cu o scală de 9 puncte [32] de același medic veterinar (JS), iar limita pentru supraponderalitate (BCS ≥ 6), așa cum a sugerat scara de scor, a fost aplicată clasificați câinii drept slabi sau supraponderali. Pe baza BCS, grupul slab (BCS 4-5) a fost format din 12 câini (medie ± SD, vârstă 5,3 ± 1,4 ani, greutate corporală 34,8 ± 2,5 kg), iar grupul supraponderal (BCS 6-8) a fost format din 16 câini 5,2 ± 1,6 ani, greutatea corporală 39,5 ± 4,6 kg), unde greutatea corporală slabă calculată a fost de 36,2 ± 3,3 kg. Greutatea corporală a diferit semnificativ între grupurile de condiții corporale (P = 0,004), în timp ce vârsta și greutatea corporală ideală nu. Frecvențele, cu care câinilor li s-au acordat resturi de masă, delicatese sau mestecate de câini nu au diferit între grupurile de condiții corporale (Tabelul 1). Concentrația serică de leptină a fost utilizată pentru a verifica gruparea stării clinice a corpului [30].

Test de masă-provocare

Colecții de probe de sânge

După examinarea fizică, un cateter (Venflon ™ Pro 1.1 * 32 mm, Becton - Dickinson, Singapore, Malaezia) a fost plasat în vena cefalică distală, iar probele de sânge au fost recoltate cu 15 minute înainte (post), apoi pe oră timp de 4 ore după masa de testare (perioada postprandială). Cateterul a fost spălat cu 2 ml de soluție salină fiziologică după fiecare recoltare de sânge. Tuburile serice (Hettich Vacuette Z Serum Clot Activator, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) au fost lăsate să se coaguleze la temperatura camerei timp de 30 de minute și apoi centrifugate la 1500 ×g timp de 10 min. Tuburile cu plasmă (Hettich Vacuette Lithium Heparin, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) au fost centrifugate (ca mai sus) direct după prelevare. Serul și plasma au fost transferate în tuburi din polipropilenă (SC Micro Tube PCR-PT, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Germania) și congelate imediat la - 70 ° C. Serul de post a fost analizat pentru biochimie ca predictor al stării generale de sănătate, iar plasma din toate punctele de timp a fost utilizată pentru analizele RMN. Cateterul a fost îndepărtat după prelevarea finală de sânge.

Analiza metabolomică bazată pe RMN

Pregătirea probelor, achiziționarea datelor RMN și procesarea spectrală

Identificarea și cuantificarea metaboliților plasmatici

Fiecare metabolit individual a fost evaluat utilizând un set de indicatori de calitate [36] pentru a determina dacă acesta era potrivit pentru includerea în statistici sau nu. Criteriile de includere pentru metaboliții plasmatici cuantificați de AQuA în studiul actual au fost: CV ≤ 20%, apariția metabolitului ≥ 50% din toate probele și nici o deviație pozițională a semnalului țintă între spectrele experimentale. S-a dovedit posibilă cuantificarea a 43 din cei 55 de metaboliți cu o calitate acceptabilă folosind AQuA. Glucoza și acidul lactic au fost excluse din setul de date în timpul evaluărilor statistice, deoarece variabilitatea lor mare a suprimat variația celorlalți metaboliți în modelele statistice multivariate. Prin urmare, 41 de metaboliți au rămas și au fost incluși în modelele multivariate finale și în analizele statistice univariate (fișier suplimentar 3).

analize statistice

Diferite modele multivariate au fost folosite ca punct de plecare pentru identificarea metaboliților discriminanți care au variat cu timpul în testul provocării mesei sau au fost legate de supraponderalitate. Metaboliții discriminanți au fost investigați în continuare prin analize de măsuri repetate model mixt. O valoare a lui P1 și pentru care intervalele de încredere (CI) bazate pe cuțite corespunzătoare nu au fost apropiate sau incluse zero au fost considerate discriminative și semnificative pentru separările observate.

Analiza de regresie logistică în trepte

Pentru fiecare moment, regresia logistică în trepte binară (adică grupuri de câini slabi și supraponderali) a fost utilizată [38] pentru a identifica metaboliții care au legătură cu supraponderabilitatea (BSC ≥ 6). Procedura logistică din pachetul SAS (2014, 9.4 Institute Inc., Cary, NC) a fost utilizată în acest scop.

Model mixt analiza măsurilor repetate

Răspunsurile plasmatice la testul de provocare a meselor au fost evaluate prin analiza măsurilor repetate cu model mixt [39] în SAS [38, 40]. În modelul statistic, grupul de condiții corporale a fost definit ca o variabilă independentă, iar valoarea de post a fost inclusă ca punct de timp. Modelul a analizat răspunsul în timp de la post la 4 ore după hrănire și diferențele dintre grupurile slabe și supraponderale. Astfel, modelul a fost capabil de comparații generale și de perechi și a reușit să corecteze comparații multiple în cadrul modelului prin ajustarea Tukey - Kramer. Transformarea logaritmică a datelor brute a fost efectuată pentru a corecta non-normalitatea (pe baza distribuției reziduurilor în cadrul modelului) în analiza statistică a concentrațiilor de carnitină și 3-hidroxibutirat. Numai metaboliții discriminanți identificați prin modele multivariate au fost testați în analiza măsurilor repetate model mixt și ulterior a fost aplicată corecția Bonferroni pentru comparații multiple. Când selecția metaboliților importanți nu a fost precedată de abordări multivariate, ci în schimb de importanță fiziologică (adică corpurile cetonice), corecția Bonferroni pentru comparații multiple a fost aplicată asupra numărului total de metaboliți (nivel de semnificație α

Rezultate

Comparații ale metabolomilor plasmatici de post și postprandial

Metabolomii plasmatici din toți cei 28 de câini analizați prin modele PCA multivariate au avut separări vizuale clare între punctele de timp postprandiale respective (1, 2, 3 și 4 h) și punctul de timp de post (fișier suplimentar 4). Separările semnificative între post și punctele de timp postprandiale respective au fost confirmate prin analize în modelele PLS-DA și prin CV-ANOVA (Tabelul 2). Analizele VIP bazate pe modelele PLS-DA au identificat 11 metaboliți discriminatori (Tabelul 2), dintre care 10 s-au dovedit a fi diferiți între punctele de timp în modelele mixte de analiză repetată (s-a aplicat corecția Bonferroni pentru comparații multiple, nivelul de semnificație α Tabelul 2 Metaboliți plasmatici care diferențiază metabolomii postului și postprandial în analiza discriminantă multivariată, cu toți cei 28 de câini incluși

Comparații ale metabolomilor plasmatici la câinii slabi și supraponderali

Nu au fost observate separări vizuale între câinii slabi și cei supraponderali la modelele PCA multivariate, fie la post, fie la 1 până la 4 ore postprandiale. Acest lucru a fost confirmat constatând că niciunul dintre modelele PLS-DA nu putea fi montat folosind câini slabi și supraponderali ca grupuri predefinite în orice moment. Cei 10 aminoacizi care au fost discriminanți de-a lungul timpului în testul de provocare a meselor nu au diferit între grupurile de condiții ale corpului (Fig. 1) și nici cele două corpuri cetonice (Fișa suplimentară 5). În analizele de regresie logistică, carnitina sa dovedit a fi legată de excesul de greutate în toate momentele (P ≤ 0,03 pentru toate), în timp ce nu s-au identificat alți metaboliți prin acest model statistic. În analiza măsurilor repetate cu model mixt, carnitina sa dovedit a fi în general mai scăzută în ceea ce privește supraponderalitatea comparativ cu câinii slabi în timpul întregului test de provocare a mesei (P = 0,005), dar răspunsul la carnitină nu a fost afectat de aportul de alimente în niciunul dintre grupuri. Fig. 2). Câinii supraponderali au prezentat o concentrație medie de carnitină de 9,4 ± 4,2 µM la post (aproximativ două treimi din concentrația câinilor slabi), iar cele două grupuri de condiții corporale au diferit semnificativ la post (P = 0,008) (Fig. 2).

plasmatică

Metaboliții discriminanți semnificativi în timp în testul de provocare a mesei, analizați în raport cu grupurile de condiții corporale. Câinii au fost împărțiți în două grupuri de condiții corporale: slab (BCS 4-5, n = 12) și supraponderal (BCS 6-8, n = 16), iar modelul mixt a fost aplicat analiza măsurilor repetate. Valori date ca concentrații µM (medie ± SEM). Probele de plasmă de post au fost prelevate cu 15 minute înainte de servirea unei mese de testare la momentul 0 (săgeată), iar concentrațiile de metaboliți la câinii slabi și supraponderali sunt prezentate ca curbe de răspuns de la post la 4 ore după hrănire. Nu au fost găsite variații dependente de timp în răspunsul global al metabolitului în ceea ce privește grupurile de condiții corporale (A-j)

Discuţie

În acest studiu, metabolomii plasmatici postprandiali au fost identificați și cuantificați pentru a înțelege mai bine metabolismul postprandial canin și pentru a investiga variațiile metabolice potențiale legate de supraponderabilitatea spontană la câinii sănătoși. Folosind o platformă analitică RMN și tehnica de cuantificare AQuA, s-a detectat un răspuns post-prandial al aminoacizilor în metabolomul canin și s-a constatat că carnitina liberă este mai mică în ceea ce privește supraponderalitatea comparativ cu câinii slabi.

În mod interesant, nu am găsit niciun efect al aportului de masă asupra concentrației plasmatice a carnitinei, deși alimentele testate conțineau precursori de carnitină derivate din carne (dar nu au aditivi l-carnitină). Rezultatele noastre indică astfel că eșantionarea după un post peste noapte comparativ cu 1-4 ore după o masă mixtă care conține carne ar putea genera rezultate comparabile asupra concentrațiilor de carnitină fără plasmă la câini. Cu toate acestea, impactul consumului recent de alimente și al diferitelor tipuri de alimente din dieta obișnuită trebuie studiat în continuare. Rezultatele noastre postprandiale sunt parțial susținute de cele ale unui studiu efectuat pe oameni care arată că carnitina fără plasmă ar putea avea o creștere postprandială întârziată, măsurată la 24 de ore după un post prelungit [56]. Prin urmare, este posibil ca o perioadă mai lungă de post sau un timp de prelevare a probelor mai mare de 4 ore postprandial să fi generat rezultate diferite.

Concluzii

Acest studiu a arătat că o abordare metabolomică poate îmbunătăți înțelegerea metabolismului canin postprandial. S-a detectat un răspuns postprandial la aminoacizi, dar nu s-au găsit variații metabolice dependente de timp în ceea ce privește supraponderalitatea. Carnitina fără plasmă a fost identificată ca un metabolit legat de supraponderalitate în această cohortă de câini sănătoși Labrador Retriever și o concentrație mai mică ar putea indica o potențială insuficiență de carnitină legată de adipozitatea spontană și de alterarea metabolismului lipidic.