Kyle J. Wolf

un Departament de Microbiologie la Universitatea Alabama din Birmingham

microbiotă

Robin G. Lorenz

un Departament de Microbiologie la Universitatea Alabama din Birmingham

b Departamentul de patologie de la Universitatea Alabama din Birmingham

Abstract

Epidemia actuală de obezitate are în mod clar multe cauze, inclusiv impactul lumii noastre moderne atât asupra dietei, cât și asupra stilului nostru de viață/activității fizice. Deși au fost recomandate multe intervenții, prevalența obezității continuă să crească și a forțat o reevaluare a intervențiilor potențiale care ar putea avea un impact. În ultimii ani s-a demonstrat definitiv că microbiota din tractul gastro-intestinal este modificată la persoanele obeze. Datele recente oferă o potențială înțelegere mecanicistă a interacțiunilor dintre microbiotă și obezitate și permit propunerea de noi intervenții potențiale pentru controlul obezității.

Introducere

În prezent, există o epidemie de obezitate în Statele Unite, cel mai recent studiu arătând o prevalență de 32,2% în rândul bărbaților adulți și de 35,5% în rândul femeilor adulte [1]. Factorii semnificativi ai acestei epidemii sunt dietele noastre, care sunt din ce în ce mai bogate în carbohidrați și grăsimi, și lipsa noastră de activitate fizică [2]. Deși critici, acești factori nu sunt în mod clar întreaga poveste; în 2004, Bäckhed și colab. [3] a propus un mecanism suplimentar care să implice microbiota gastrointestinală (GI).

Populația rezidentă a microbiotei este o parte esențială a dezvoltării și maturității căii intestinale a gazdei și a sistemului imunitar și, prin urmare, a ajuns să fie considerată de unii un organ virtual cunoscut sub numele de microbiom [4]. Microbiomul intestinal este totalitatea microbilor (bacterii, viruși etc.), a elementelor lor genetice (genomi) și a interacțiunilor de mediu în cadrul pistei GI. Acest microbiom conține de peste 10 ori mai multe organisme decât numărul de celule dintr-un corp uman, dar, spre deosebire de alte organe, compoziția sa este oarecum instabilă. Populațiile rezidente de bacterii pot fi modificate în decurs de 24 de ore de la schimbarea dietei; prin urmare, obținerea unei imagini unificate a microbiomului poate fi o propunere provocatoare [5].

Implicarea microbiotei intestinale în epidemia de obezitate a fost sugerată mai întâi de faptul că șoarecii C57BL/6 fără germeni adulți (adică fără bacterii) au avut o creștere cu 60% a conținutului de grăsime corporală atunci când au fost convenționați (adică, colonizat) cu microbiota cecală de la un șoarece C57BL/6 sănătos și normal [3]. Sa presupus că mecanismul pentru această creștere a conținutului de grăsime corporală include faptul că microbiota ar avea capacitatea de a regla recoltarea de energie din componentele alimentare și, prin urmare, de a modifica stocarea de energie în gazdă. De la acea publicație originală din 2004, au existat acum 138 de publicații de date primare și 60 de recenzii care au fost găsite printr-o căutare PubMed pentru obezitate și microbiotă. Aceste publicații au condus la propunerea a trei mecanisme unice prin care microbiota poate avea impact asupra obezității gazdei, iar acestea sunt discutate în această revizuire.

Abordări experimentale ale studiului microbiomului

Studiul microbiomului intestinal este unic printre sistemele de organe, deoarece microbiomul poate fi aruncat și completat și există posibilitatea unică de a studia acest „organ” pe perioade lungi de timp prin obținerea de probe fecale de la un singur individ. Acest tip de analiză a condus la conceptul de „enterotipuri” ale microbiomului intestinal și datele recente de la 22 de indivizi au indicat un număr limitat de stări simbiotice gazdă-microbiene care ar putea răspunde diferit la diete [6]. Cu toate acestea, datele din probele fecale trebuie interpretate cu precauție, deoarece mai multe grupuri au indicat faptul că comunitățile de microbiote fecale diferă de bacteriile asociate mucoasei din tractul GI [7, 8]. Deoarece tehnicile de studiu, măsurare și modificare a microbiomului sunt oarecum unice în domeniu și uneori nu se încadrează în repertoriul obișnuit de abilități pe care alți biologi le-ar folosi, am detaliat câteva abordări experimentale în această revizuire.

Cultura și identificarea bacteriilor

Cultura și identificarea bacteriilor au fost utilizate pe scară largă pentru a identifica componentele bacteriene patogene sau rezidențiale ale fecalelor sau țesutului [9]. Această metodă utilizează practici de identificare fenotipică de lungă durată, cum ar fi motilitatea, forma, structura coloniei și utilizarea zahărului/metabolitului. Cu toate acestea, multe specii rămân nedefinite, deoarece în prezent nu există o metodă cunoscută pentru cultivarea acestor grupuri în afara tractului intestinal și, din acest motiv, au fost dezvoltate metode mai avansate folosind amplificarea nucleotidică.

Hibridizarea fluorescentă in situ

Hibridizarea in situ a fluorescenței (microscopie-FISH) a fost utilizată istoric pentru a identifica bacteriile prezente în secțiuni de țesut fără purificare a acidului nucleic. Pe scurt, sondele bazate pe acid nucleic radioactiv sau fluorescent care vizează ARN ribozomal 16S sunt utilizate pentru a pătrunde probele histologice conservate și pentru a permite vizualizarea unor organisme specifice [10]. Această procedură are avantajul localizării precise a bacteriilor, dar nu dă rezultate cantitative. O metodă mai nouă care combină FISH cu citometrie în flux (FCM-FISH) nu mai permite localizarea țesuturilor, dar atunci când este combinată cu pete de ADN este o metodă rapidă, fiabilă și cantitativă pentru analiza probelor de bacterii mixte în fecale [11].

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei

Reacția în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qRT-PCR) este o a doua metodă pentru enumerarea numărului de bacterii prezente în fecale (sau probe de țesut), dar se bazează pe extracția acidului nucleic din probe. qRT-PCR are o sensibilitate și o reproductibilitate foarte ridicate și este foarte rapid de realizat [12]. La fel ca în cazul FISH, microorganismele specifice sunt detectate pe baza sondelor specifice secvenței, dar numai organismele cu secvențe cunoscute pot fi cuantificate.

Electroforeza cu gradient de denaturare a gelului și 454 piroza secvențierea

Există două metode pe bază de acid nucleic care pot identifica organisme necunoscute și neculturabile. Electroforeza pe gel cu gradient de denaturare (DGGE) este o metodă de creare a unei imagini fizice a diversității bacteriene printr-un gel de denaturare bidimensional (2D). ADN-ul este amplificat și separat pe gelul 2D, unde produsele amplificate migrează conform conținutului de G: C și sunt vizualizate ca benzi unice pe gel [13]. Bacteriile pot fi identificate printr-o combinație de purificare a ADN-ului din gel și metode de secvențiere Sanger [14]. Deși metodele de secvențiere Sanger pot fi utilizate pentru a identifica numeroase secvențe bacteriene în probe GI, noua tehnologie de pirozecvențare cu randament ridicat oferă o metodă mai rapidă și mai rentabilă pentru analiza microbiomului total. 454 Pirosequencing este o metodă care diferă de secvențierea tradițională prin faptul că nu măsoară terminarea lanțului, ci se bazează pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidelor. Această metodă a fost acum combinată cu o nouă abordare a codului de bare, care permite secvențierea simultană a mai multor probe individuale [15, 16].

Abordare metatranscriptomică și rezonanță magnetică nucleară

Utilizarea acestor tehnici rapide și extinse de secvențiere a relevat diversitatea enormă a microbiotei GI și natura sa care se schimbă rapid [5, 17]. Prin urmare, studii recente au combinat aceste metode cu analiza expresiei genelor bacteriene. Această abordare metatranscriptomică a identificat un „microbiom de bază” la expresia genei, mai degrabă decât la descendența organismului, care este asociat cu obezitatea [17, 18]. O a doua metodă de analiză a funcției acestui „microbiom de bază” este prin metabolomică. Rezonanța magnetică nucleară (RMN) poate fi utilizată pentru a măsura molecule foarte mici, cum ar fi aminoacizii individuali, carbohidrații și lipidele/acizii grași. Prin utilizarea proprietăților magnetice unice de la fiecare moleculă, RMN măsoară radiația magnetică dintr-o probă și este capabilă să măsoare sute de molecule. Acest lucru este optim atunci când se încearcă măsurarea moleculelor mici fie din ser, fie chiar din fecale [19]. Folosind acest tip de tehnică, metaboliții microbieni generați în timpul fermentării colonice a alimentelor pot fi determinați și se poate determina impactul lor ulterior asupra metaboliților din sânge și țesuturi [20-22].

Modele fără germeni

Conceptul de modificare a populațiilor comensale pentru îmbunătățirea sănătății umane a fost mult timp studiat, dar a fost folosit abia recent pentru manipularea fenotipului obez. Prin utilizarea modelelor de șoarece, putem extrage informații despre modul în care fiecare grup individual de bacterii contribuie la microbiom și la gazdă. Modelele GF sunt șoareci sau șobolani care nu conțin bacterii. Acești șoareci sunt optimi ca martori negativi și, de asemenea, sunt de neprețuit ca „sursă curată” atunci când caută să mono-colonizeze o persoană cu bacterii singure pentru a înțelege cum au impact asupra gazdei [23-25]. Unul dintre experimentele de referință care indică rolul microbiotei în obezitate a utilizat șoareci GF, care au fost colonizați cu o „microbiotă obeză” sau cu o „microbiotă slabă”. Transferul „microbiotei obeze” a dus la șoareci cu o creștere mai mare a grăsimii corporale totale și a identificat în mod clar microbiota intestinală ca fiind un factor care contribuie la povestea obezității [26]. Șoarecii care sunt colonizați cu o anumită bacterie cunoscută sunt denumiți gnotobiotici (sau „viață cunoscută”) și ne pot ajuta să înțelegem rolul bacteriilor specifice în evoluția inflamației și a bolilor [24].

Mecanisme care leagă microbiota de obezitate

Consum modificat de energie

Bacteriile rezidente din tractul gastro-intestinal sunt responsabile pentru o parte semnificativă din aportul nostru de energie, permițându-ne accesul la surse de energie care altfel ar fi putut fi nedigerabile. Firmicutele crescute la șoarecii obezi și la oameni s-au dovedit a fi mai abili în descompunerea carbohidraților altfel nedigerabili și transformarea lor în produse energetice absorbabile [5, 17, 36, 37]. În cazul în care microbiota s-ar schimba între indivizii slabi și obezi, s-ar părea probabil că această modificare ar afecta eficiența producției/absorbției de energie în tractul gastro-intestinal și ar putea facilita sau inhiba progresia către obezitate. Când a fost analizată prin cipuri genetice, s-a observat că bacteriile de la indivizi obezi au o expresie crescută în seturile genetice specifice motilității, transcripției și metabolismului zaharidelor [26].

Creșterea metabolismului acizilor grași

Una dintre primele publicații care a implicat microbiota intestinală ca factor de mediu care a reglementat depozitarea grăsimilor a observat că șoarecii GF C57BL/6 convenționalizați cu microbiota normală au o expresie suprimată a factorului adipos indus de repaus intestinal/proteinei asemănătoare angiopoietinei 4 (Fiaf/Angptl4 ) [3]. Fiaf/Angptl4 este o țintă a receptorului nuclear PPAR-α din ficat, dar este exprimată și în țesutul adipos alb, mușchiul scheletic și intestinul [44]. O funcție a Fiaf/Angptl4 pare a fi capacitatea sa de a crește trigliceridele plasmatice prin capacitatea sa de a inhiba activitatea lipoproteinelor lipazice. Prin utilizarea șoarecilor knockout Fiaf s-a stabilit că suprimarea Fiaf/Angptl4 este esențială pentru depunerea trigliceridelor indusă de microbiota în adipocite observate după convenționalizarea șoarecilor GF [3, 33]. De asemenea, s-a demonstrat recent că suplimentul chinezesc Rhizoma coptidis poate reduce greutatea adiposă a corpului și că un mecanism potențial pentru această constatare este inhibarea creșterii bacteriene intestinale și o creștere ulterioară a expresiei Fiaf/Angptl4 în intestin [45].

Inflamația asociată cu microbiota

De mai bine de 15 ani, a fost clar că țesutul adipos la modelele obeze are o expresie crescută a citokinelor proinflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală-α (TNF-α). Acest lucru a fost raportat pentru mai multe modele de rozătoare de obezitate, inclusiv diabet (db/db), obezi (ob/ob) și șoareci tubby (cada/cadă) și șobolanul Zucker (fa/fa), precum și pacienții obezi [46, 47]. Acest TNF-α este produs în principal de macrofage ale țesutului adipos și mediază rezistența la insulină prin capacitatea sa de a reduce activitatea tirozin kinazei receptorului pentru insulină [48, 49]. Dietele despre care se știe că induc obezitatea și rezistența la insulină, cum ar fi dieta HF, pot crește expresia TNF-α [50]. Cu toate acestea, inducerea obezității și rezistența la insulină sunt ameliorate dacă șoarecii sunt deficienți fie în TNF-α, fie în TNF-αR [51, 52].

Dar de ce o dietă IC și/sau obezitatea duc la o stare inflamatorie cronică? Inițial, ipoteza a fost că acizii grași nutriționali crescuți ar putea duce la activarea receptorilor asemănători cu taxele (în mod specific TLR4) și inflamații ulterioare [53]. Cu toate acestea, așa cum s-a discutat mai sus, o dietă HF mută microbiomul intestinal foarte repede la o scădere a bacteroidelor și la o creștere atât a Firmicutelor, cât și a Proteobacteriilor [5, 29]. O propunere este că această modificare a microbiotei intestinale ar putea duce la activarea crescută a TLR4 și, prin urmare, ar putea fi parțial responsabilă de starea inflamatorie cronică observată la indivizii obezi.

Pentru a aborda această întrebare, Cani și colab. [54] a întrebat inițial dacă o dietă HF ar crește concentrațiile plasmatice de LPS, un ligand TLR4 produs de bacterii gram-negative. Acest nivel scăzut de LPS în plasmă a fost denumit „endotoxemie metabolică”. Datele au indicat faptul că o dietă HF la șoareci C57BL/6 a crescut nivelul plasmatic de LPS și că perfuzia directă de LPS a imitat efectele fiziologice ale unei diete HF [54]. Mai mult, efectele dietei HF au fost ameliorate la șoarecii lipsiți de o componentă a complexului receptorului TLR4 - CD14. Același grup a continuat să implice bacteriile intestinale în concentrațiile plasmatice crescute de LPS prin utilizarea antibioticelor orale cu spectru larg, care au redus semnificativ nivelurile de microbiota intestinală și nivelurile de LPS plasmatică [55]. În plus, administrarea unui prebiotic (oligofructoză) a dus la o creștere a bacteriilor intestinale gram-pozitive (inclusiv Bificobacteria) și la o scădere a LPS plasmatic [56].

Aceste observații permit considerarea că LPS-ul plasmatic ar putea fi un biomarker al stării persoanelor predispuse la obezitate sau impactul probioticelor terapeutice asupra microbiotei intestinale asociate obezității. Mai multe studii recente indică faptul că răspunsul poate fi da. Primul studiu a investigat activitatea serului LPS la mai mult de 7000 de subiecți cu o urmărire de 10 ani. Acest studiu a concluzionat că atât pacienții diabetici diagnosticați anterior, cât și pacienții cu diabet nou diagnosticat (diabet incident) aveau niveluri mai ridicate de LPS decât persoanele fără diabet [57]. În plus, terapeutica, cum ar fi probioticele orale (Lactobacillus casei), atunci când sunt administrate șoarecilor cu obezitate indusă de dietă, pot îmbunătăți nu numai rezistența la insulină, dar pot reduce și nivelurile plasmatice de proteine ​​care leagă LPS (un marker al endotoxemiei) [58].

Această implicare a activării TLR a fost confirmată într-un model de șobolan Sprague-Dawley alimentat cu o dietă HF, care poate prezenta fie un fenotip predispus la obezitate, fie un fenotip rezistent la obezitate. Toți șobolanii predispuși la obezitate, dar nici unul dintre șobolanii rezistenți la obezitate, au crescut activarea TLR4 [37]. Suport suplimentar provine dintr-un experiment care utilizează șoareci Webster elvețieni gnotobiotici și convenționali, care a demonstrat că șoarecii crescuți în mod convențional din dieta HF au crescut nivelurile hepatice ale markerului inflamator seric amiloid A, dar că acest efect al dietei HF a fost ameliorat în deficiența MyD88 șoareci (MyD88 este o componentă a căii de semnalizare TLR) [59]. Deși TLR4 a fost receptorul cel mai implicat în acest mecanism, s-a demonstrat recent că șoarecii lipsiți de TLR5 au sindrom metabolic [60]. Acest lucru se datorează cel puțin parțial unei microbiote intestinale modificate, deoarece transferul microbiotei de la un șoarece cu deficit de TLR5 la un șoarece gnotobiotic de tip sălbatic a conferit receptorilor sindromul metabolic [60]. În mod curios, un studiu recent asupra insectelor a demonstrat, de asemenea, un sindrom metabolic care este indus de o infecție intestinală cu protozoare [61].

Mecanismul pentru această LPS plasmatică crescută din microbiota intestinală este probabil o permeabilitate intestinală crescută. Șoarecii C57BL/6 hrăniți cu o dietă HF au permeabilitate crescută la molecule mici, cum ar fi FITC-dextran și, de asemenea, au scăzut sau au modificat expresia proteinelor joncționale strânse occludin și zonulin-1 [55]. Rezultate similare s-au văzut în dieta HF - șobolani Sprague-Dawley predispuși la obezitate, dar nu și la șobolani rezistenți la obezitate [37]. Impactul microbiotei intestinale asupra permeabilității s-a arătat recent că implică peptida-2 (GLP-2) asemănătoare glucagonului [62]. Dacă șoarecilor ob/ob li se administrează un agonist GLP-2, atunci permeabilitatea intestinală este redusă, iar integritatea joncțiunii strânse și fenotipul inflamator sistemic sunt îmbunătățite. Deoarece GLP-2 are receptori nu numai în intestin, ci și în creier, este o posibilitate fascinantă de a exista o axă intestin-creier care ar putea lega microbiota intestinală de comportamentele de hrănire [63]. Infuzia intracerebroventriculară de GLP-2 poate inhiba consumul de alimente și, în consecință, modificările microbiotei intestinale pot avea efecte pe termen lung asupra axei intestin-creier și a homeostaziei greutății corporale [64].

Înființarea Microbiomului

Se pare clar că microbiota poate avea un impact asupra metabolismului energetic și poate fi asociată cu obezitatea și endotoxemia metabolică. Dacă da, atunci apar întrebările: Cum ne dobândim microbiota? Ce se știe că influențează microbiota prezentă? Ne putem modifica microbiota într-un mod prestabilit? Multe studii au arătat că colonizarea bacteriană inițială a intestinului este la naștere, în primul rând de la mamă și/sau alți îngrijitori [65, 66]. Cu toate acestea, lucrările mai noi s-au concentrat acum asupra impactului microbiotei asupra creșterii în greutate în timpul sarcinii și asupra faptului dacă aceasta afectează greutatea ulterioară a copilului mai târziu în viață.

Pentru a determina dacă această compoziție microbiotică modificată are de fapt vreo corelație cu greutatea la copii, același grup de copii a fost urmărit până la vârsta de 7 ani [71]. Niciunul dintre grupurile bacteriene care sa dovedit a fi semnificativ la mamele supraponderale sau descendenții lor nu a fost corelat cu creșterea în greutate crescută în copilărie; cu toate acestea, nivelurile crescute de S. aureus în timpul copilăriei s-au corelat cu un copil supraponderal la vârsta de 7 ani. Un al doilea studiu a investigat, de asemenea, dacă factorii despre care se știe că modifică microbiota intestinală au un efect asupra greutății corporale la vârsta de 7 ani [72]. Factorii investigați au inclus modul de livrare, IMC matern înainte de sarcină și expunerea timpurie la antibiotice (Flegal KM, Carroll MD, Ogden CL, Curtin LR. Prevalența și tendințele obezității în rândul adulților din SUA, 1999-2008. JAMA: jurnalul american Asociația medicală. 2010; 303 (3): 235-241. [PubMed] [Google Scholar]