Kyung-Jin Min

1 Departamentul de ecologie și biologie evolutivă, Universitatea Brown, Providence, RI 02912 SUA

Thomas Flatt

1 Departamentul de ecologie și biologie evolutivă, Universitatea Brown, Providence, RI 02912 SUA

Indrek Kulaots

2 Divizia de Inginerie, Universitatea Brown, Providence, RI 02912 SUA

Marc Tatar

1 Departamentul de ecologie și biologie evolutivă, Universitatea Brown, Providence, RI 02912 SUA

Abstract

S-a susținut că prelungirea duratei de viață prin restricția dietei în Drosophila are loc fără a limita caloriile. Aici măsurăm direct caloriile asimilate de muște atunci când sunt menținute pe diete complete și cu restricții. Am constatat că aportul caloric este redus la toate dietele care prelungesc durata de viață. Muștele care urmează o dietă cu conținut scăzut de drojdie au o durată lungă de viață și consumă aproximativ jumătate din caloriile muștelor din dietele bogate în drojdie, indiferent de conținutul energetic al dietei în sine. Deoarece aportul caloric se corelează cu concentrația de drojdie și, prin urmare, cu aportul fiecărui metabolit din această componentă dietetică, este prematur să se concluzioneze pentru Drosophila că caloriile nu explică extinderea duratei de viață.

1. Introducere

Consumul redus de alimente fără malnutriție extinde durata de viață a multor organisme, inclusiv drojdie, nematod, muscă de fructe și rozătoare (Koubova și Guarente, 2003; Masoro, 2000; Partridge și colab., 2005). La rozătoare, aportul redus de calorii totale extinde durata de viață, totuși limitarea nutrienților specifici poate crește și supraviețuirea (Miller și colab., 2005; Yu și Masoro, 1985; Zimmerman și colab., 2003). Este o dezbatere actuală dacă limitarea caloriilor este o caracteristică a nutriției responsabile de o durată de viață extinsă în muștele fructelor, Drosophila melanogaster. În lucrările recente pentru abordarea acestei întrebări, Mair și colab. (2005) au manipulat simultan drojdia și zahărul pentru a varia calitatea nutrienților și valoarea calorică. Supraviețuirea a crescut substanțial în dietele care restricționau drojdia în timp ce păstrau zahărul constant, în timp ce durata de viață s-a schimbat puțin atunci când zahărul era restricționat în dietele cu o cantitate constantă de drojdie. În special, Mair și colab. a argumentat că aportul caloric efectiv a fost egal pentru femeile cărora li s-au administrat diete cu valoare energetică egală, deoarece femeile de testare solitare își extind proboscida pe durate egale. Deoarece femelele cu diete izocalorice cu drojdie scăzută trăiesc mai mult decât cele cu drojdie bogată, autorii susțin că restricția dietei (DR) mediază durata de viață, deoarece limitează componentele nutritive specifice ale drojdiei, mai degrabă decât caloriile.

Concluzia lui Mair și colab. necesită aportul caloric real să fie proporțional cu conținutul energetic al mediului dietetic. Cu toate acestea, relația dintre extinderea proboscisului și aportul de nutrienți este necunoscută, iar studiile recente confirmă faptul că aportul de alimente poate să nu fie constant între dietele care variază în concentrația de drojdie sau zahăr (Carvalho și colab., 2005; Min și Tatar, 2006a). Se observă că femelele cresc și scad rata consumului atunci când sunt hrănite cu o dietă restricționată. Prin urmare, este posibil ca aportul caloric real să difere între femele în funcție de concentrația drojdiei atunci când acestea sunt prezentate cu diete cu valoare energetică similară.

Pentru a testa dacă valoarea energetică a mediului dietetic este proporțională cu aportul caloric real, am replicat experimentele de manipulare a dietei ale Mair și colab. și simultan măsurate supraviețuirea și fluxul caloric. Un buget energetic complet ar măsura caloriile din metabolism, excreție, modificări ale masei corporale și alocarea totală la ouă. Nu luăm în considerare rata metabolică, deoarece nu diferă între melanogaster complet hrănit și DR (Hulbert și colab., 2004). Nu luăm în considerare excrețiile; în măsura în care această rată diferă între tratamente, cel mult vom subestima discrepanța dintre fluxul caloric real și valoarea energetică a dietei. Prin urmare, în practică, măsurăm fluxul caloric ca valoare energetică totală a ouălor și a țesutului corporal pe parcursul a cinci zile și în fiecare dintre tipurile de dietă descrise în Mair și colab. (2005).

2. Materiale și metode

2.1. Demografie și mass-media

Larvele tulpinii Canton-S au fost cultivate pe mediu standard de porumb/zahăr/drojdie/agar (Elgin și Miller, 1980), completate cu mai multe boabe de drojdie vie. Adulții nou închisi au fost colectați peste 48 de ore și au fost repartizați în cuști de demografie de 1 litru la o densitate de 200 de indivizi (100 femele, 100 bărbați). Flacoane cu alimente (25 X 95 mm) au fost atașate la fiecare cușcă printr-un tub de plastic de 25 mm și schimbate la fiecare 2 zile, moment în care muștele moarte au fost îndepărtate, sexate și înregistrate. Au fost stabilite trei cuști replicate pentru fiecare dintre cele patru tratamente dietetice. Cuștile au fost menținute la 25 ° C, 40% umiditate relativă și un ciclu lumină-întuneric de 12 ore.

Compoziția fiecărei diete urmează proiectul lui Mair și colab. (2005), deși media noastră conține, de asemenea, o concentrație uniformă de făină de porumb (Tabelul 1). Făina de porumb acționează ca un coloid pentru a menține omogenitatea amestecului nutritiv de zahăr și drojdie. Drojdia SAF uscată, autolizată, a fost cumpărată de la Lesaffre Yeast Corporation (Milwaukee, WI). Conținutul energetic al mediului este calculat din valoarea calorică individuală și din contribuția proporțională a fiecărei componente. Mediile cu drojdie ridicată/cu conținut scăzut de zahăr și drojdie scăzută/cu conținut ridicat de zahăr au fost „izocalorice” la aproximativ 99 kcal/100 ml.

tabelul 1

Compoziția dietei, conținutul caloric și durata de viață conferită.

Tratament dietetic Compoziție (în 100 ml apă) Energie în 100 ml mediu, kcal Durată medie de viață, d (IC 95%)
Drojdie mare/Zahăr ridicat16g drojdie, 16g zaharoză, 5,2g făină de porumb146,830 (30 - 34)
Drojdie mare/Zahăr scăzut16g drojdie, 4g zaharoză, 5,2g făină de porumb98,832 (30 - 34)
Drojdie scăzută/Zahăr ridicat4g drojdie, 16g zaharoză, 5,2g făină de porumb98,846 (42 - 48)
Drojdie scăzută/Zahăr scăzut4g drojdie, 4g zaharoză, 5,2g făină de porumb50,848 (46 - 48)

2.2. Colectarea corpului și a ouălor pentru calorimetria bombei

Larvele tulpinii Canton-S au fost cultivate așa cum s-a descris mai sus. După ecluziune, 250 de femele și 50 de masculi au fost sortați în cuști de demografie de 1L; au fost stabilite patru cuști replicate plus o rezervă pentru fiecare tratament dietetic. Densitatea în cazurile replicate a fost menținută constantă prin înlocuirea muștelor moarte cu aceiași adulți în vârstă din cușca de rezervă a tratamentului. Am măsurat valoarea calorică a femelelor din fiecare replică ca fiind caloriile tuturor ouălor depuse de la eclosie (ziua zero) până la ziua a cincea, plus caloriile tuturor adulților la sfârșitul zilei a cincea. Deoarece cuștile au fost stabilite cu adulți care s-au dezvoltat pe aceeași dietă, dar înainte de a consuma orice dietă pentru adulți, diferențele în valoarea energetică a țesutului în ziua a cincea reflectă diferențele cauzate de adulții care se hrănesc cu diferitele diete.

Ouăle au fost colectate din vase de hrană (60 X 15 mm) care au fost atașate cu un tub de plastic de 25 mm și pâlnie la fiecare cușcă. Vasele erau schimbate zilnic, ouăle erau spălate liber, liofilizate și cântărite. În ziua a cincea, vasele cu alimente au fost îndepărtate timp de patru ore înainte de a colecta adulți pentru a ne asigura că muștele nu conțin alimente nedigerate. Toate femelele din fiecare cușcă au fost liofilizate și cântărite.

2.3. Calorimetre

Am folosit calorimetrie de ardere (de exemplu, Lamprecht și Schmolz, 1999; Schmolz și colab., 2005) pentru a determina conținutul de căldură al corpurilor și al ouălor combinate în replici. Fiecare probă a fost amestecată cu n-tetradecan de calitate calorimetrică (Sigma, St. Louis, MO) la un raport de masă de 1: 5 (specimen: tetradecan) și combinate într-un calorimetru cu bombă de oxigen static (Parr Instrument, Moline, IL; modelul nr. 1341). Am stabilit anterior cantitatea optimă de n-tetradecan pentru a aprinde probele de insecte la combustie completă și am calculat valoarea calorică netă a probei prin scăderea conținutului de căldură cunoscut al primerului.

3. Rezultate

Durata de viață (Tabelul 1) și supraviețuirea (Figura 1A) au fost crescute la femeile menținute în diete cu concentrații diluate de drojdie (supraviețuire mediană: drojdie scăzută, 46 d; drojdie ridicată, 32 d; test Log-Rank, χ 2 = 333,7, p 2 = 2,01, p = 0,16). Dieta cu conținut scăzut de drojdie/conținut ridicat de zahăr și dieta cu conținut ridicat de drojdie/cu conținut scăzut de zahăr au același conținut caloric (Tabelul 1), dar muștele hrănite cu aceste diete au o durată de viață semnificativ diferită, așa cum au raportat Mair și colab. Ne trasăm rezultatele (Figura 1B) în același format ca Mair și colab. și recapitulează rezultatele lor publicate.

dietei

(A) Longevitate. Reducerea conținutului de drojdie a dietei a avut un efect mult mai mare asupra duratei de viață decât reducerea conținutului de zahăr din dietă. (B) Calorii virtuale: complot al duratei medii de viață în raport cu valoarea energetică a dietei. Datele sunt prezentate cu formatul figurii 3 în Mair și colab. (2005). (C) Calorii asimilate: complot al duratei medii de viață (între media replicată și s.e.) relativ la caloriile corpului și ouăle depuse pe cap de locuitor (între media replicată și s.e.). Corelația dintre durata de viață și caloriile asimilate este puternică și semnificativă.

Spre deosebire de aceste rezultate, muștele hrănite cu diete izocalorice, de fapt, diferă semnificativ în caloriile asimilate. Atunci când fluxul de energie este măsurat prin numărarea caloriilor din mușchiul soma și din ouăle produse pe parcursul a 5 zile, conținutul caloric pe muște este mai mare pentru muștele hrănite cu o dietă bogată în drojdie decât muștele hrănite cu o dietă săracă în drojdie. Există o corelație puternică între durata de viață și conținutul caloric (R 2 = 0,98, F (1,2) = 109,99, p = 0,009, Figura 1C).

De asemenea, am observat modele de asimilare a nutrienților care abordează întrebările legate de hrănirea compensatorie. Greutatea uscată a corpului feminin și ouăle depuse pe parcursul a 5 zile au fost mai mari la muștele hrănite cu o dietă bogată în drojdie (Figura 2), dar amploarea acestei afectări a depins de concentrația zahărului din dietă. Muștele hrănite cu dietă bogată în drojdie au produs mai multe ouă atunci când dieta avea un conținut scăzut de zahăr decât un nivel ridicat de zahăr. În mod similar, muștele cu un conținut ridicat de drojdie/conținut scăzut de zahăr au produs mai multe ouă și au câștigat mai multă greutate decât muștele hrănite cu un conținut scăzut de drojdie/zahăr, chiar dacă aceste diete au avut același conținut energetic.

Masa femelelor (ovar și ovulele imature inclusiv) și a ouălor produse a fost estimată de la ecluzie până la vârsta de 5 zile. Drojdia ridicată induce o producție ridicată de ouă și creșterea în greutate. Rețineți că conținutul scăzut de zahăr crește și mai mult producția de ouă.

4. Discutie

Consumul de alimente a fost explorat de-a lungul deceniilor de la construirea lui D. melanogaster într-un model experimental, deși nu cu o dietă despre care se știe că prelungește durata de viață (Driver și colab., 1986; Edgecomb și colab., 1994; Tatar, 2007). Primul studiu care a întârziat îmbătrânirea prin restricția dietei a fost raportat acum doar câteva zeci de ani (Chippindale și colab., 1993). Femelele menținute cu o soluție relativ diluată de drojdie alimentară au prelungit durata de viață cu 25-30% și au depus concomitent mai puține ouă. În timp ce mediul diluat a redus probabil consumul de drojdie, hrănirea nu a fost măsurată. De asemenea, acest proiect timpuriu nu a avut drept scop să distingă efectele caloriilor relative de cele ale metaboliților specifici drojdiei. Studiile pentru a aborda aceste întrebări au apărut doar în ultimii ani.

Grupul nostru a măsurat simultan durata de viață și rata de hrănire a femelelor împerecheate menținute pe o dietă constantă pe bază de agar, cu zahăr uniform, cu concentrații variate de drojdie autolizată (Min și Tatar, 2006a). Durata de viață a fost cea mai mare la dieta de 2% drojdie și progresiv mai mică pe măsură ce concentrația de drojdie a crescut. Am estimat rata de hrănire de la absorbția unui colorant solubil, nedigestibil. Femelele cu 16% drojdie au consumat de patru ori mai multă dietă (colorant) decât cele cu 2% dietă. Această diferență disproporționată în consum sugerează că dieta concentrată de drojdie nu numai că conferă un nivel ridicat de aport alimentar, ci stimulează și comportamentul de hrănire, probabil ca răspuns la cerințele metabolice ale producției crescute de ou.

Rezultate diferite au fost observate de Carvalho și colab. (2005) unde femelele virgine au fost prezentate cu medii care au variat atât în ​​zahăr, cât și în extract de drojdie; supraviețuirea a fost cea mai mare la dieta cu 1% drojdie de zahăr. Consumul a fost măsurat prin absorbția unui nucleotid solubil CTP [α- 32 P] trasor. Spre deosebire de observațiile noastre, rata de hrănire a crescut la dietele diluate progresiv. Astfel, femeile care au luat dieta de 1% au consumat mai puține alimente (trasor), dar cantitatea consumată a fost de doar 4/10 mii aportul măsurat pe dieta de 15% cu drojdie de zahăr. Hrănirea a fost stimulată la concentrații dietetice scăzute, poate pentru că aceste medii au redus atât zahărul, cât și drojdia sau pentru că hrana compensatorie are loc în absența reproducerii. Noile noastre date sugerează, de asemenea, că există o hrană compensatorie atunci când conținutul de zahăr este redus, deoarece muștele hrănite cu dietă bogată în drojdie/cu conținut scăzut de zahăr au câștigat mai multă masă și au produs mai multe ouă decât muștele hrănite cu dietă bogată în drojdie/bogate în zahăr.

Această deducție necesită ca achiziția de nutrienți să fie proporțională cu concentrația de nutrienți din dietă. Datele noastre de aici nu susțin această ipoteză. După cum sa raportat, durata de viață a crescut foarte mult în dietele cu concentrație redusă de drojdie și a existat un impact redus asupra supraviețuirii din dietele cu zahăr redus, iar când ne-am trasat datele privind durata de viață în raport cu valoarea energetică a dietei, recapitulăm rezultatele Mair și colab. (2005). Cu toate acestea, femeile cu diete izo-calorice nu au asimilat aceeași cantitate de calorii. Femeile hrănite cu dietă cu conținut scăzut de drojdie consumă aproape jumătate din caloriile femeilor care urmează o dietă bogată în drojdie, iar durata de viață a fost puternic corelată cu caloriile asimilate. Astfel, femelele care urmează o dietă cu conținut scăzut de drojdie au consumat mai puține calorii, mai puțină drojdie și au îmbătrânit încet. Din acest proiect experimental, este prematur să se excludă caloriile ca factor determinant al duratei de viață a Drosophila, deoarece aportul de calorii din drojdie este exact confundat cu consumul tuturor metaboliților din drojdie.

În cele din urmă, poate fi necesar să tratăm mușca mai mult ca și rozătoarele: controlăm direct aportul de alimente sau măsurăm în mod explicit nutrienții asimilați. Reglarea experimentală a aportului alimentar, de fapt, a fost aplicată muștei fructelor mediteraneene (Carey și colab., 2002) și muștei (Cooper și colab., 2004). La aceste muște relativ mari nu a existat un efect pozitiv al aportului redus de nutrienți asupra duratei de viață, contrar precedenței. Scalarea acestor protocoale pentru a studia efectul aportului de alimente definit cu Drosophila ar trebui să fie o prioritate ridicată.

În mod similar, coloranții și nucleotidele marcate în cel mai bun caz sunt proxy parțial al consumului, deoarece marchează doar aportul de solut. Adultul Drosophila nu are piese bucale de mestecat și metaboliții insolubili din drojdie încorporați sub suprafața mediului sunt relativ inaccesibili. Măsurarea izotopilor stabili de carbon și azot din dietă poate remedia această problemă și poate măsura cu precizie achiziția de nutrienți și fluxul metabolic. Fluturele Heliconius charitonius a fost demonstrat prin astfel de metode de a dobândi aminoacizi esențiali din polenul alimentar pentru a produce ouă (O'Brien și colab., 2003). Recent am adaptat această abordare pentru Drosophila pentru a determina modul în care adulții folosesc zahărul din dieta larvelor (Min și colab., 2006). Cifra de carbon din zahărul alimentar achiziționat prin larve este rapidă și aproape completă în grupul de metaboliți folosiți la producerea ouălor și în țesutul somatic adult. Aplicarea acestei abordări cu carbonul și azotul din drojdia alimentară are potențialul de a identifica modul în care metaboliții specifici sunt dobândiți și alocați întreținerii somatice atunci când restricția dietei extinde durata de viață.

Eforturile de a clarifica modul în care practica restricționării dietei cu Drosophila afectează absorbția nutrienților progresează, dar sunt incomplete. Este clar că diluarea drojdiei alimentare reduce consumul de alimente și prelungește durata de viață. Pe de altă parte, nu putem rezolva încă efectele caloriilor de cele ale metaboliților specifici drojdiei, darămite să distingem efectele componentelor din drojdie, cum ar fi carbohidrații, sterolii, acizii grași, vitaminele, mineralele și aminoacizii. Aminoacizii merită atenție deoarece metionina redusă extinde durata de viață la șobolani și la șoareci (Miller și colab., 2005; Zimmerman și colab., 2003). Dacă supraviețuirea D. melanogaster poate fi îmbunătățită prin limitarea aminoacizilor din dietă rămâne dificil de evaluat deoarece dietele definite optimizate pentru larve nu sunt potrivite pentru adulți (Lamb, 1978; Min și Tatar, 2006b). Poate că este ironic faptul că, în timp ce instrumentele pentru disecarea bazei moleculare ale metabolismului și a îmbătrânirii în Drosophila au avansat enorm în ultimii ani, suntem în prezent blocați pe o problemă fundamentală a gastronomiei: Cum măsurăm și controlăm ceea ce este mâncat de o muscă?

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de National Institutes of Health, Ellison Medical Foundation, Swiss National Science Foundation și Roche Research Foundation.

Note de subsol

Declinarea responsabilității editorului: Acesta este un fișier PDF al unui manuscris neditat care a fost acceptat spre publicare. Ca serviciu pentru clienții noștri, oferim această versiune timpurie a manuscrisului. Manuscrisul va fi supus copierii, compunerii și revizuirii dovezilor rezultate înainte de a fi publicat în forma sa finală citabilă. Vă rugăm să rețineți că, în timpul procesului de producție, pot fi descoperite erori care ar putea afecta conținutul și că toate responsabilitățile legale care se aplică jurnalului se referă.