Abstract

Introducere

Șoarecii C57BL/6J (6J) sunt una dintre cele mai utilizate tulpini genetice în domeniul cercetării diabetului. Acești șoareci prezintă simptome de intoleranță la glucoză încă de la vârsta de 6 săptămâni (1) și sunt extrem de sensibili la apariția obezității, a rezistenței la insulină și a diabetului de tip 2 evident atunci când sunt plasați pe o dietă bogată în grăsimi (2,3). Într-o serie elegantă de experimente efectuate de Toye și colab. (4), fenotipul intolerant la glucoză al tulpinei 6J a fost mapat la o deleție naturală cu cinci exoni în cadru în gena nucleotidei transhidrogenazei (NNT) a nicotinamidei (5,6). Experimente ulterioare în care NNT funcțional a fost reintrodus prin expresie transgenică a salvat cu succes alterarea secreției de insulină/fenotipul de eliminare a glucozei șoarecilor 6J (5), confirmând astfel pierderea funcției NNT ca sursă de intoleranță la glucoză. Se crede că absența NNT crește expunerea la peroxidul mitocondrial în celula β ca răspuns la absorbția și metabolismul glucozei, reducând astfel raportul ATP/ADP (printr-un mecanism încă neidentificat), întârziind închiderea canalului KATP și afectând în cele din urmă secreția de insulină (7).

comparație

În plus față de NNT, dovezile recente detaliază variații genetice pe scară largă care cuprind polimorfisme multiple nucleotidice unice, indeli mici și variante structurale care disting diferențele 6J și 6N (8). Genele afectate acoperă diferite căi biologice și, ca atare, explică probabil numeroasele diferențe fenotipice documentate între șoarecii 6J și 6N (8). În ciuda disparității genotipice și fenotipice clare între șoarecii 6J și 6N, cele două linii sunt denumite adesea șoareci „C57BL/6”, creând atât discrepanță, cât și confuzie în câmp. În acest punct, într-o recenzie recentă a literaturii, Fontaine și Davis (12) au raportat că p.m., dacă nu se specifică altfel. Glucoza din sânge a fost monitorizată utilizând sistemul de monitorizare a urmelor alfa ale glucozei din sânge din probele colectate la vena cozii distale. După o măsurare inițială a glicemiei, glucoza (2 g/kg FFM) sau insulina (0,5 U/kg FFM) au fost injectate intraperitoneal, iar măsurătorile glucozei au fost făcute la fiecare 10-20 min pentru o perioadă de 90-120 min. Insulina a fost evaluată utilizând un kit ELISA disponibil comercial (Merck Millipore).

[3+ H] 2-Deoxiglucoză absorbție

Imediat după îndepărtare, mușchii extensorului digitorului lung au fost așezați în puțuri preumplute care conțin tampon Krebs-Henseleit plus 1 mmol/L piruvat cu barbotare continuă de 95% O2 și 5% CO2 într-o baie de apă controlată de temperatură (37 ° C). După o perioadă de preincubare de 20 de minute, mușchii au fost transferați în puțuri proaspete, care conțineau sau nu insulină (50 mU/ml), timp de 30 de minute. Mușchii au fost apoi transferați în godeuri de incubație conținând 5 mmol/L 2-deoxiglucoză (2-DG), 10 mmol/L manitol, 0,2 µCi/mL [3+ H] 2-DG, 0,01 µCi/mL [14 C] d - manitol, cu sau fără insulină (50 mU/ml). După incubare, mușchii au fost transferați în tamponul Krebs-Henseleit rece ca gheața pentru a opri reacția, au fost tăiați din țesutul conjunctiv și au fost înghețați până la momentul analizei. Mușchii înghețați au fost cântăriți și solubilizați în 0,1 ml de NaOH 0,5 N. Mușchii solubilizați și probele de mediu de incubație au fost numărate într-un contor de scintilație lichid Beckman LS 5000 TD presetat pentru a număra simultan 14 canale C și 3 H. Datele sunt exprimate ca micromoli pe gram pe oră.

Evaluarea metabolismului energiei întregului corp

Sistemul TSE LabMaster (TSE Systems, Chesterfield, MO) a fost utilizat pentru a determina VO2 și VCO2, raportul de schimb respirator, aportul de alimente și apă și consumul de energie. Senzorii cu infraroșu au fost folosiți pentru a înregistra activitatea ambulatorie în axe tridimensionale (x, y și z). Toate măsurătorile raportate reprezintă media a cel puțin două cicluri de lumină sau întuneric de 12 ore. Măsurătorile grăsimii și ale masei corporale slabe au fost determinate folosind EchoMRI-500 (EchoMRI, Houston, TX).

Pregătirea pachetelor de fibre permeabilizate și mitocondriilor izolate

Pregătirea pachetului de fibre a fost adaptată de la metodele anterioare și a fost descrisă temeinic (19). Fibrele permeabilizate au fost preparate atât din mușchiul gastrocnemius roșu (RG), cât și din cel gastrocnemius alb (WG). Mitocondriile izolate au fost preparate din ficat de șoareci 6J și 6N prin centrifugare diferențială. Ficatii au fost omogenizați în tampon de izolare mitocondrială (300 mmol/L zaharoză, 10 mmol/L HEPES, 1 mmol/L EGTA și 1 mg/ml BSA [pH 7,1]). Omogenatul a fost filat la 500 × g timp de 10 min, iar supernatantul rezultat a fost filat la 9.000 × g timp de 10 min, ambele la 4 ° C. Peleta mitocondrială a fost spălată în tampon de izolare mitocondrială fără BSA și rotită din nou la 9.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C. Peletele mitocondriale finale au fost resuspendate în tampon de izolare mitocondrială fără BSA, iar conținutul de proteine ​​a fost determinat prin testul de proteină Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).

Respirație mitocondrială și măsurători ale emisiilor de H2O2

Măsurătorile de înaltă rezoluție ale consumului de O2 au fost efectuate la 37 ° C în tamponul Z, suplimentat cu creatină monohidrat (20 mmol/L), utilizând OROBOROS O2K Oxygraph așa cum s-a descris anterior (18). Emisia de H2O2 mitocondrială a fost măsurată fluorometric la 37 ° C prin intermediul sistemului de detectare Amplex Ultra Red (10 μmol/L)/peroxidază de hrean (3 U/mL) (excitație/emisie 565/600) (18). Blebbistatin (25 μmol/L) a fost prezent în timpul tuturor experimentelor de consum de O2 și de emisie de H2O2 care implică fibre permeabilizate pentru a preveni contracția (19). Pentru experimentele privind rata emisiilor de peroxid de hidrogen (JH2O2) care implică mitocondrii hepatice, s-au utilizat 0,1 mg/ml mitocondrii pentru fiecare test. Toate experimentele privind consumul de O2 și emisiile de H2O2 au fost protocoale scurte efectuate la normoxie (∼200 nmol O2/mL).

Glutation redus, disulfură de glutation și redus glutation/disulfură de glutation

Pentru derivatizarea GSSG, omogenatul de celule 200 μL a fost deproteinizat în 200 μL acid percloric 15% și centrifugat timp de 5 minute la 20.000 × g. Supernatantul rezultat (200 μL) a fost diluat în 1.000 μL de 0,1 mol NaOH de două ori pentru a crește pH-ul înainte de a reacționa cu O-ftaladehidă 0,1%. O-ftaladehida reacționează cu GSSG la pH ridicat (~ 12) pentru a forma un produs fluorescent detectabil la lungimi de undă de excitație/emisie de 350/420. Probele GSSG au fost prelucrate folosind un tampon de fosfat de sodiu de 25 mmol/L conținând 15% metanol de calitate HPLC la pH de 6. Probele au fost preluate printr-un sistem HPLC Shimadzu Prominence echipat cu o coloană cu capace Purospher STAR RP-18 (4,6 × 150 mm, 3 μm; EMD Millipore) la un debit de 0,5 mL/min. Probele au fost cuantificate folosind standarde preparate în condiții identice și normalizate la conținutul de proteine ​​măsurat în omogenizarea musculară prin testul acidului bicinchoninic.

Testul Western Blotting și Malondialdehyde

Mușchii anteriori tibiali și ficatul au fost omogenizați în tampon RIPA (# 89901; Thermo Scientific), suplimentat cu cocktailuri inhibitoare de protează/fosfatază (Roche) pentru detectarea catalazei, superoxidului dismutaza 2 (SOD2), izocitrat dehidrogenazei 2 (IDH2) și hidroxinononol (HNE) prin Western blot. Pentru experimentele care implică țesuturi stimulate de insulină, mușchii gastrocnemius și ficatul au fost omogenizați în tampon de liză SDS (20 mmol/L Tris-HCI, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L EDTA, 4% SDS și 20% glicerol [pH 6,8 ]), suplimentat cu cocktailuri inhibitoare de protează/fosfatază (Roche). Anticorpii principali utilizați au fost achiziționați de la Abcam (numere de catalog ab1877; SOD2, ab13533; și IDH2, ab131263), Percipio Biosciences (HNE; 24325), Cell Signaling Technology (fosforilat [p] -Akt, 4060; Akt, 9272; p-GSK -3β, 9336; și GSK-3β, 9315) și Sigma-Aldrich (GAPDH; G8795). Malondialdehida (MDA) a fost evaluată în lizatele anterioare și hepatice tibiale folosind un kit de testare disponibil comercial (Northwest Life Science Specialties).

Statistici

Pierderea NNT crește potențialul de emisie de JH2O2 în fibrele permeabilizate. Fibrele permeabilizate au fost preparate din RG de șoareci 6N și 6J. Emisia JH2O2 a fost evaluată prin intermediul sistemului Amplex Ultra Red/hrean peroxidază, iar fluorescența resorufinei a fost convertită în pmoli de H2O2 printr-o curbă standard H2O2. A: Urmă reprezentativă a unui experiment de emisie JH2O2 efectuat în prezența piruvatului (Pyr; 1 mmol) plus carnitină (Carn; 5 mmol) în fibrele 6N și 6J. După 5 min, s-au adăugat carmustină (BCNU; 100 μmol) și AF (1 μmol) pentru a inhiba tamponarea peroxidului. Numerele de deasupra fiecărei secțiuni de urmărire corespund cu ratele medii de emisie de JH2O2 (pmol/s/mg greutate uscată) pentru acea stare din N = 5 replici experimentale. B și C: Același proiect experimental ca în A, cu excepția condiției substratului a fost succinat (10 mmol) (B) sau piruvat (1 mmol) plus malat (2 mmol) (C). Pentru C, primul număr enumerat este pentru șoareci 6N, urmat de 6J.

Intoleranța la glucoză se dezvoltă în 24 de ore după tratamentul HFD la șoareci 6J și 6N