Contribuție de Richard D. Palmiter

obezitatea

Abstract

Șoarecii nulați ai receptorului melanocortinei-4 (Mc4r) prezintă obezitate cu debut tardiv. Pentru a determina dacă metabolismul aberant contribuie la obezitate, consumul de alimente de la șoareci Mc4r-nul a fost limitat la (hrănit în pereche) la cel consumat de șoareci de tip sălbatic (WT). Femelele Mc4r-nule hrănite în perechi au menținut greutăți corporale intermediare față de cele ale femelelor WT și femelele Mc4r-nule hrănite în pereche, în timp ce hrănirea în pereche a normalizat greutățile corporale ale șoarecilor masculi Mc4r-nuli. Nivelurile de grăsime și leptină în circulație au fost crescute atât la șoareci de sex masculin cât și de sex feminin hrăniți cu perechi Mc4r-nul comparativ cu șoareci WT. Consumul de oxigen al șoarecilor Mc4r-nul cu greutăți corporale similare cu martorii WT a fost redus cu 20%. Activitatea locomotorie a tinerilor masculi non-obezi Mc4r-nul a fost semnificativ mai mică decât cea a bărbaților WT; cu toate acestea, locomoția femelelor tinere neobeze a fost normală. Temperatura centrală a șoarecilor Mc4r-nul a fost normală și au răspuns normal la expunerea la frig. Femelele tinere nonobeze Mc4r-nule nu au putut induce proteina 1 de decuplare (UCP1) în țesutul adipos maro ca răspuns la administrarea de leptină periferică, în timp ce mARN-ul UCP1 a crescut cu 60% la femelele WT. Aceste rezultate indică faptul că deficiența Mc4r îmbunătățește eficiența calorică, similară cu cea observată în sindromul obezității agouti și la șoarecii cu receptor melanocortin-3-nul.

Analizele mutațiilor la locusul agouti (A) împreună cu studiile farmacologice care implică proteina agouti recombinantă au oferit informații despre controlul pigmentării și al greutății corporale. Peptida agouti este în mod normal produsă și secretată tranzitoriu în piele, unde antagonizează acțiunea hormonului de stimulare a α-melanocitelor (α-MSH) care acționează asupra receptorului melanocortinei-1. Această interacțiune are ca rezultat depunerea benzilor de pigment galben în firele de păr negre, dând naștere la culoarea stratului de agouti (1, 2). La șoareci au fost identificate mai multe deleții cromozomiale spontane care plasează gena agouti sub controlul promotorilor din apropiere exprimate omniprezent (3). Șoarecii heterozigoți cu mutații galbene letale (A y) și galbene viabile (A vy) au un sindrom cunoscut sub numele de „sindromul galben al șoarecelui”, caracterizat prin obezitate la debutul maturității, creștere liniară crescută, hiperleptinemie, hiperinsulinemie, diabet zaharat noninsulin-dependent, și blana galbenă (4). Homozigoții pentru aceste alele mor in utero din cauza pierderii genelor esențiale (5).

Șoarecii cu mai multe copii ale genei agouti exprimate sub controlul unui promotor specific pielii au manifestat blană galbenă, dar nu au prezentat fenotipuri legate de obezitate caracteristice sindromului galben al șoarecelui (6). Studiile in vitro au arătat că proteina agouti ar putea, de asemenea, să antagonizeze receptorul melanocortinei-4 (Mc4r) (7), care este exprimat în primul rând în sistemul nervos cu niveluri ridicate în hipotalamus (8, 9). Deoarece hipotalamusul joacă un rol critic în reglarea poftei de mâncare și a ratei metabolice, sa emis ipoteza că antagonismul Mc4r de către agouti ar putea fi responsabil pentru obezitatea șoarecilor A y și A vy. Șoarecii cu întrerupere țintită a genei Mc4r (Mc4r-nul) au reprodus fenotipul obezității șoarecilor cu sindrom agouti, susținând această ipoteză (10).

Se consideră că întreruperea semnalizării leptinei sau a-MSH în hipotalamus este principala cauză a obezității prezentate de șoarecii A y (11) și Mc4r-nul. Leptina este un hormon produs de țesutul adipos care comunică nivelul depozitelor de energie din corp către creier. Animalele care nu au leptină funcțională, șoareci ob/ob, sunt obezi morbid și au o rată metabolică scăzută. Leptina semnalizează prin neuronii care conțin pro-opiomelanocortină (POMC) din nucleul arcuat, precum și din alți nuclei din hipotalamus (12). POMC este precursorul α-MSH, un agonist al lui Mc4r. Acești neuroni care exprimă POMC se proiectează către hipotalamusul lateral și nucleul paraventricular, unde se află Mc4r. Activarea acestei căi de semnalizare a leptinei - melanocortinei sa dovedit a afecta aportul de alimente și rata metabolică. Șoarecii adulți A nu răspund la s.c. leptină și necesită de 100 de ori mai multă leptină pentru a inhiba hrănirea (13). De asemenea, șoarecii adulți Mc4r-null sunt rezistenți la acțiunea leptinei (i.p. sau administrată central) în ceea ce privește aportul de alimente (14).

Atât șoarecii Mc4r-null (10), cât și șoarecii A y (4, 15-17) devin hiperfagi; cu toate acestea, mai multe experimente sugerează că o componentă metabolică contribuie la obezitatea lor. Experimentele efectuate la șoareci A vy (16) și șoareci cu receptor melanocortin-3 (18) indică faptul că aceste tulpini mutante de șoareci sunt mai eficiente în stocarea caloriilor ca țesut adipos decât controalele de tip sălbatic (WT). Măsurătorile consumului de oxigen indică faptul că șoarecii obezi A y au o rată metabolică de odihnă mai mică atunci când sunt testați între 2 și 12 luni (19), dar nu și când sunt testați la 6 săptămâni. În cele din urmă, rata metabolică a adulților Mc4r-null, care au fost semnificativ mai grele decât șoarecii martori, a fost mai mică decât martorii slabi sau martorii obezi induși de dietă atunci când s-a normalizat la greutatea corporală totală (20).

Dacă Mc4r este un mediator critic al metabolismului și al termogenezei induse de dietă, atunci șoarecii nuli Mc4r ar trebui să fie mai eficienți din punct de vedere metabolic decât șoarecii de control și ar trebui să câștige mai multă greutate (ca țesut adipos) decât șoarecii de control cu ​​același consum de alimente eficiența alimentării). Am efectuat experimente pe termen lung, hrănire în perechi, care au dezvăluit că șoarecii Mc4r-nul, precum șoarecii cu sindromul galben al șoarecelui și șoarecii receptorului melanocortin-3-nul (18), arată o predispoziție de a stoca calorii ca țesut adipos. Pentru a caracteriza în continuare acest defect metabolic, am testat consumul de oxigen, activitatea locomotorie, capacitatea de reacție la frig și capacitatea leptinei de a induce UCP1 mRNA la șoareci Mc4r-nul.

Materiale și metode

Toate procedurile pentru animale au respectat orientările Institutelor Naționale de Sănătate și au fost aprobate de Comitetul Facilității de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Washington.

Experimente de alimentare în perechi.

Șoareci de generație F4 de heterozigoți de fond mixt 129/Sv × C57BL/6J pentru alela Mc4r perturbată au fost crescuți pentru a genera șoareci Mc4r-null și WT (10). Genotiparea a fost efectuată așa cum este descris (14). Șoarecii au fost menținuți pe șoricelul standard al șoarecelui (șoricelul standard de laborator al lui Harlin Teklad H8604) la 22 ° C pe un ciclu de lumină - întuneric de 12 ore. Aportul alimentar al șoarecilor WT a fost măsurat zilnic începând cu vârsta de aproximativ 5 săptămâni. În fiecare zi, șoarecilor de sex masculin și de sex masculin Mc4r-null găzduiți în grup li s-a dat cantitatea medie de alimente consumate de colegii lor WT cu sex în ziua precedentă (27). Grupurilor separate de șoareci de sex masculin și femele Mc4r-null adăpostite li s-a permis accesul ad libitum la alimente. Greutățile corporale au fost măsurate săptămânal.

Măsurători ale grăsimii.

WT, șoarecii Mc4r-null și Mc4r-nul hrăniți în perechi cu acces ad libitum la alimente au fost uciși la vârsta de 38-46 săptămâni. Țesutul adipos alb scapular inguinal, retroperitoneal, reproductiv, precum și țesutul adipos brun scapular au fost imediat disecați și cântăriți.

Măsurătorile serice.

Sângele din trunchi a fost colectat de la șoareci hrăniți ad libitum în tuburi de rotire Microtainer conținând EDTA (Becton Dickinson) și imediat centrifugat la 2.000 rpm timp de 10 minute la temperatura camerei. Plasma a fost colectată și congelată la -60 ° C. Testele ELISA (Chrystal Chem, Chicago) au fost efectuate pentru a măsura nivelurile de leptină și insulină. Nivelurile de glucoză au fost determinate cu ajutorul analizorului de glucoză YSI Select (Yellow Springs Instruments).

Activitatea locomotorie.

Activitatea ambulatorie a șoarecilor WT și Mc4r-null (4-8 săptămâni) au fost măsurate în cuști transparente din plexiglas (40 × 20 × 20-cm) înconjurate de un cadru din aluminiu echipat cu grinzi infraroșii (San Diego Instruments). Șoarecii au fost așezați în cuști în timpul zilei, iar pauzele de grindă au fost măsurate în prima oră. Animalele au rămas în cuști peste noapte cu hrană și apă disponibile ad libitum, iar pauzele de lumină și întuneric ale fasciculului au fost măsurate începând cu a doua zi. Numărul de pauze consecutive ale fasciculului care au avut loc în fiecare oră într-o perioadă de 24 de ore au fost măsurate și convertite în metri parcurși utilizând distanța dintre grinzi (8,8 cm) ca factor de conversie.

Toleranță la rece.

Temperatura corpului central al șoarecilor a fost măsurată la temperatura camerei cu un teletermometru (modelul 43TA, Yellow Springs Instruments), echipat cu o sondă rectală (modelul 402, Yellow Springs Instruments). Sonda a fost introdusă 5 cm în colon. Șoarecii au fost apoi plasați într-o cameră menținută la 4 ° C, iar temperaturile corpului au fost măsurate în mod similar la 1, 4, 8 și 24 de ore după expunerea la frig.

Măsurarea consumului indirect de O2 (VO2).

Șoarecilor WT și NPF Mc4r-nuli, cu vârsta de 7,5–8,5 săptămâni, li s-a permis să se aclimatizeze la condițiile experimentale prin plasarea în camera unui calorimetru cu circuit deschis indirect (Oxymax; Columbus Instruments) timp de 3 ore în ziua testului. Măsurătorile au fost efectuate începând cu aproximativ ora 12:00. Debitul de aer proaspăt de intrare a fost de 0,5 litri/min, debitul probei a fost de 0,5 litri/min, iar camera a fost prelevată timp de 60 s, cu un timp de reinstalare de 60 s. Valorile raportate sunt mijloacele a 60 de măsurători pe o perioadă de 2 ore pentru fiecare animal. Nu a existat nicio diferență semnificativă în consumul de oxigen între femei și bărbați din fiecare genotip; în consecință, rezultatele pentru aceste două grupuri au fost combinate.

Măsurători ale ARNm UCP1.

Injecțiile cu leptină (șoarece recombinant; Calbiochem) au fost efectuate așa cum este descris (25). Pe scurt, șoarecii femele WT în vârstă de 5,5 săptămâni și Mc4r-nuli au fost injectați o dată pe zi cu 20 μg/g de greutate corporală leptină de șoarece recombinată sau cu un volum echivalent de vehicul PBS, la 3 ore după începerea ciclului de lumină timp de 3 zile într-un Cameră de 22 ° C. La trei ore după ultima injecție, șoarecii au fost uciși și BAT a fost îndepărtată. Acizii nucleici totali au fost izolați din BAT și nivelurile relative de UCP 1 mARN au fost cuantificate așa cum s-a descris (28).

Analize statistice.

Toate valorile sunt raportate ca medii ± SEM. Măsuri repetate ANOVA și testul post hoc al lui Tukey au fost efectuate pentru Fig. 1. Testele post hoc ale ANOVA și ale lui Tukey au fost efectuate pentru Tabelul 1 și Fig. 2 și 7. Au fost efectuate testele t ale elevilor pentru Fig. 3–6.

Curbele de creștere. (A) Greutăți corporale săptămânale de 12 WT, 14 PF Mc4r-nul și nouă NPF Mc4r-nule femele. *, Prima săptămână în care greutatea corporală a diferit semnificativ între femeile WT și NPF (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Nivelurile serice de leptină, insulină și glucoză la șoarecii WT, PF Mc4R-nul și NPF Mc4R-nul

Consum de mâncare. Consumul de alimente a fost măsurat timp de 5 zile și raportat ca o medie zilnică. Măsurătorile au fost făcute la prima vârstă, când greutățile corporale erau semnificativ diferite și la 14 săptămâni. (A) Cinci femele WT și cinci NPF Mc4r-nule. (B) Cinci bărbați WT și cinci NPF Mc4r-nul. *, Diferență semnificativă față de șoarecii WT (șoareci P vy, la care doar masculii erau hiperglicemici (10, 29).

Greutatea corporală crescută a femelelor NPF Mc4r-nule la vârsta de 12 săptămâni și a bărbaților NPF Mc4r-nuli la 10 săptămâni, a apărut în absența oricărei hiperfagii semnificative (Fig. 3). Aceste rezultate susțin un rol pentru Mc4r în reglarea metabolismului.

Temperatura corpului central și capacitatea de reacție la frig. Temperatura miezului corpului șoarecilor adăpostiți individual a fost măsurată înainte și la 1, 4, 8 și 24 de ore după plasarea șoarecilor la 4 ° C. (A) Opt WT și șapte șoareci femele Mc4r-nul. (B) Șase șoareci masculi WT și șase Mc4r.

Efectul leptinei asupra mARN-ului UCP1 în BAT. Șoarecii femele WT (n = 6) și Mc4r-null (n = 6) au fost adăpostiți individual timp de 1 săptămână înainte de tratamentul cu leptină. Șoarecii au fost injectați zilnic cu 20 μg/g greutate corporală leptină sau un volum echivalent de vehicul PBS timp de 3 zile. Hibridizarea soluției a fost utilizată pentru a măsura nivelurile de ARNm UCP1 față de conținutul total de acid nucleic. *, Creștere semnificativă față de vehicul (șoareci P vy (16) și demonstrând o tendință de a stoca calorii ca țesut adipos. Frigeri și colab. (16) nu au observat un efect dimorf sexual în studiul lor privind eficiența utilizării alimentelor în A Nivelurile serice de leptină la șoarecii PF Mc4r-nul au reflectat, de asemenea, adipozitatea lor crescută. Nivelurile normale de glucoză și insulină serice care se hrănesc în pereche, susținând aportul caloric redus ca tratament eficient pentru diabetul zaharat de tip 2.

Cele mai convingătoare date care sugerează că Mc4r funcționează în reglarea metabolismului este că greutatea corporală crescută a femelelor NPF Mc4r-nule la vârsta de 12 săptămâni și a bărbaților NPF Mc4r-nuli la 10 săptămâni, a avut loc în absența oricărui hiperfagie semnificativă (Fig. 3). Abia la 14 săptămâni de vârstă, când femelele NPF Mc4r-nule erau de 4,3 ± 1,4 g, iar masculii erau cu 10,9 ± 1,8 g mai grei decât controalele WT, au început să consume mult mai multe alimente. Acest rezultat sugerează că deficitul metabolic este principalul motiv pentru care animalele Mc4r-nule câștigă în greutate și că hiperfagia apare secundar pentru a susține animalele greutatea corporală crescută. Această ipoteză este susținută și de măsurători ale ratei metabolice la animalele tinere cu greutăți corporale similare. Am constatat că animalele Mc4r-null au consumat cu 20% mai puțin oxigen decât șoarecii WT de aceeași greutate (Fig. 6).

Semnalizarea Mc4r ar putea influența metabolismul în mai multe moduri. Șoarecii Mc4r-nul au răspuns normal la temperaturi scăzute; cu toate acestea, femelele tinere, slabe Mc4r-nule nu au indus mRNA UCP1 ca răspuns la leptină. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu cele raportate de Satoh și colab. (21) care au descoperit că inducerea UCP1 de către leptină (administrată central) ar putea fi blocată de administrarea centrală a antagonistului Mc4r, SHU9119. Luate împreună, aceste rezultate sugerează că Mc4r este implicat în medierea activării leptinei SNS și a termogenezei ulterioare induse de dietă.

Leptina reglează atât consumul de alimente, cât și consumul de energie (31); cu toate acestea, nu este clar dacă efectele leptinei asupra acestor procese apar prin intermediul unor căi de semnalizare separate sau comune. Anterior, am arătat că, în ceea ce privește consumul de alimente, șoarecii obesi Mc4r-null erau rezistenți la leptină, în timp ce șoarecii tineri Mc4r-null slabi erau parțial sensibili la leptină, sugerând că rezistența la leptină în ceea ce privește aportul de alimente la șoarecii Mc4r-null este cel puțin parțial o consecință a obezității animalelor (14). Aici, arătăm că incapacitatea leptinei de a induce UCP1 mRNA la femelele Mc4r-nule este evidentă atunci când șoarecii sunt tineri și slabi. Astfel, șoarecii Mc4r-nul sunt insensibili la cheltuielile de energie mediate de leptină înainte de a deveni complet rezistenți la inhibarea indusă de leptină a aportului alimentar. Acest rezultat întărește ideea că reglarea defectuoasă a cheltuielilor de energie de către șoareci Mc4r-nul duce la obezitate și că o creștere compensatorie a apetitului are loc după ce animalele au crescut greutatea corporală.

Datele prezentate aici indică faptul că șoarecii Mc4r-nuli sunt mai eficienți din punct de vedere metabolic decât șoarecii WT. O constatare similară a fost raportată recent pentru șoarecii cu receptor melanocortin-3-nul (18). Mutațiile Mc4r la om au fost asociate cu o formă moștenită în mod dominant de obezitate (32, 33). Multe aspecte ale reglării homeostaziei energetice și ale sistemului central al melanocortinei par a fi similare la șoareci și oameni (revizuită în ref. 34). Cu toate acestea, nu este clar dacă ființele umane cu mutații Mc4r sunt mai eficiente din punct de vedere metabolic. Un raport recent a indicat faptul că caucazienii cu mutații Mc4r heterozigoți au o rată metabolică bazală normală, în timp ce subiecții indieni/pakistanezi, cu mutații Mc4r heterozigoți sau homozigoți, arată o tendință spre devieri negative ale ratei metabolice bazale (35).

Note de subsol

↵ † Adresa actuală: Merck & Co., Box 2000, Rahway, NJ 07065.

↵ § Cui trebuie adresate cererile de reimprimare. E-mail: palmiteru.washington.edu .

Articol publicat online înainte de tipărire: Proc. Natl. Acad. Știință. SUA, 10.1073/pnas.220409497.