Informații despre articol

Abstract

rezumat

Transplantul de celule epiteliale în tampoane de grăsime curățate este o tehnică larg utilizată în studiul biologiei glandelor mamare. A fost descris pentru prima dată în 1959 și a rămas o tehnică valoroasă, cel mai recent coroborat cu analiza anlagenului mamar de la șoareci knockout cu fenotip letal embrionar sau defect de reproducere, precum și pentru testele de celule stem epiteliale mamare sau analiza celulelor precanceroase. Glandele mamare, spre deosebire de majoritatea celorlalte organe, se dezvoltă în principal postnatal. Când cantitatea mică de epiteliu endogen prezent în tamponul de grăsime al unui șoarece prepubertal este îndepărtată, acest clearance lasă un mic mediu natural care poate fi repopulat cu celule epiteliale furnizate exogen. Celulele cu potențial de dezvoltare adecvat (celule stem sau celule progenitoare) pot regenera porțiunea epitelială a glandei mamare după pubertate și sarcină. Clearance-ul convențional al tamponului de grăsime este o procedură chirurgicală implicată. Am îmbunătățit tehnica și am minimizat operația și timpul de recuperare, menținând în același timp o îndepărtare eficientă a epiteliului endogen din tamponul de grăsime mamară.

elimina

Transplantul de celule în tampoane de grăsime eliminate de la șoarece este adesea utilizat pentru a studia comportamentul celulelor stem epiteliale mamare sau pentru a analiza efectele modificărilor genetice asupra creșterii, diferențierii și apoptozei glandei mamare. Structura ușor accesibilă a glandei mamare și faptul că glanda nu este un organ vital fac posibile aceste experimente. Tehnica a fost descrisă pentru prima dată de DeOme și colab. (1959). Cursul experimental necesită îndepărtarea epiteliului endogen din tamponul de grăsime al șoarecilor tineri; fragmentele de țesut sau suspensiile celulare pot fi apoi introduse în tamponul de grăsime curățat. Aceste celule transplantate pot crește și se diferențiază și formează un arbore ductal aproape indistinct de cel endogen.

Deși tehnica de curățare și transplant a glandei mamare a fost dezvoltată la sfârșitul anilor 1950, este încă foarte util să răspundem la multe dintre întrebările experimentale moderne. Transplantul de celule în tamponul de grăsime și analiza consecventă a structurilor rezultate au fost utilizate pentru a evalua proprietățile celulelor stem și capacitatea lor de regenerare (a se vedea Smith & Boulanger 2003, Visvader 2006 și pentru referințe la acestea). Celulele care au fost modificate de infecțiile retrovirale au fost analizate pentru a evalua consecințele expresiei oncogenei asupra glandei mamare (Edwards 2000) și au oferit informații despre tumorigeneză mamară (Daniel și colab. 1968, Medina 1976, Edwards și colab. 1996).

Transplantul de fragmente de țesut mamar de la șoareci transgenici sau knockout în tampoane de grăsime curățate de șoareci de tip sălbatic a fost utilizat atunci când manipularea genetică a dus la un fenotip animal steril sau letal embrionar. Mediul tamponului de grăsime de la șoareci de tip sălbatic oferă condiții normale de dezvoltare și, astfel, se pot distinge efectele fenotipice care rezultă din modificări genetice în compartimentele epiteliale sau stromale (Klinowska & Streuli 2000, Parmar & Cunha 2004).

Celulele mamare precanceroase de șoarece pot fi menținute și progresia lor canceroasă poate fi observată în tamponul de grăsime eliminat (Cardiff și colab. 2006). De asemenea, este posibil să se umanizeze tamponul de grăsime pentru a sprijini creșterea celulelor epiteliale ale sânului uman normal și canceros (Kuperwasser și colab. 2004, Liu și colab. 2006).

Șoarecii au 10 glande mamare, câte cinci pe fiecare parte, situate ventro-lateral. Se pot distinge ca glandele toracice, numerele 1-3, și glandele inghinale, numerele 4 și 5. Glanda inghinală numărul 4 este cel mai ușor accesibilă și, prin urmare, este utilizată în mod obișnuit pentru experimentele de compensare și transplant.

La nivelul embrionului de șoarec în curs de dezvoltare se poate observa o mică anlagie a glandei mamare. Arborele glandular crește în timpul pubertății și diferențierea funcțională apare în glanda adultă în timpul sarcinii și alăptării. Proliferarea celulelor epiteliale și extinderea canalelor epiteliale umple tamponul în timpul pubertății. Mugurii terminali terminali sunt esențiali pentru extinderea conductelor în timpul pubertății. La sarcină, sunt specificate celulele alveolare, care se diferențiază în celule secretoare care sintetizează proteinele din lapte. După ce încetează alăptarea, glanda mamară suferă moarte și remodelare celulară programată, cunoscută sub numele de involuție, revenind la o stare comparabilă cu glanda virgină (Hovey & Trott 2004).

Înainte ca celulele să poată fi transplantate, este necesară îndepărtarea completă a țesutului epitelial endogen din tampon. Acest lucru este practic cel mai fezabil în primele trei săptămâni după naștere. În acest timp, structura ductală este limitată la proximitatea mamelonului. După pubertate, canalele se extind până la marginile tamponului de grăsime mamară și nu pot fi îndepărtate complet fără a distruge tamponul de grăsime. După îndepărtarea celulelor epiteliale, tamponul de grăsime mamară rămas este un mic mediu favorabil proliferării și diferențierii epiteliale. Dacă celulele epiteliale rămân după eliminare, ele pot crește împreună cu celulele transplantate și pot complica interpretarea analizei histologice.

Metoda chirurgicală actuală implică îndepărtarea anlagei folosind un microscop de disecție (Figurile 1a - c). Pielea abdominală este deschisă de o mare Da-incizie în formă. Anlajul glandei mamare este extras cu partea din tamponul de grăsime cea mai apropiată de mamelon. Vasele de sânge nutritive și zona mamelonului sunt cauterizate, precum și conexiunea cu a cincea glandă inghinală, iar rana este închisă. Celulele ductale imediat sub mamelon rămân și pot contamina transplantul, dacă mamelonul este lăsat în piele. Incizia are o lungime de câțiva centimetri și o cantitate mare de țesut este deconectat de la corp.

Figura 1 Compararea metodelor vechi și noi de eliminare a tamponului de grăsime mamară. Metoda veche: (a) Linii de incizie pentru metoda clasică de a curăța fadul de grăsime mamară. (b) După incizie, pielea este pliată înapoi pentru a expune întreaga glandă mamară. Aceeași procedură s-ar repeta și pe partea contralaterală. (c) Rana este închisă folosind șase cleme Michel. Nouă metodă: (d) cercurile din jurul mamelonului marchează incizia pentru a rezeca anlajul mamar. (e) Pielea din jurul mamelonului este excizată și mamelonul și doar o parte din tamponul de grăsime mamară este expus. (f) Rana este închisă folosind două cleme Michel

Am modificat procedura pentru a minimiza rana în urma intervenției chirurgicale și, în același timp, a obținut o rată de succes ridicată pentru eliminarea grăsimii. Vă prezentăm o variantă a metodei originale descrisă de DeOme și colab. (1959), care poate fi considerat mai puțin dăunător pentru animale și o îmbunătățire a tehnicii.

Materiale și metode

Animale

Șoareci femele C57BL/6NCrl, BALB/cAnNCrl (Charles River, Sulzfeld, Germania) și șoareci transgenici cu proteină fluorescentă verde îmbunătățită (EGFP) (C57BL/6Tg (ACTB-EGFP) Osb, Jackson Labs, Bar Habor, ME, SUA) au fost adăpostiți în conformitate cu legile germane privind bunăstarea animalelor și cu liniile directoare pentru adăpostirea animalelor de la Federația Asociațiilor Europene de Științe a Animalelor de Laborator (FELASA). Au fost date hrană și apă ad libitum. Animalele erau ținute în cuști deschise sau cuști ventilate individual. Experimentele pe animale au fost examinate de către comitetul pentru bunăstarea animalelor din Regierungspräsidium Darmstadt.

Îndepărtarea tamponului de grăsime

Șoareci C57BL/6 sau BALB/c femele la vârsta de 3-4 săptămâni au fost folosiți pentru eliminare. Șoarecii au fost anesteziați cu ketamină (Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Germania) 100 mg/kg BW și xilazină (Rompun, Bayer Vital, Leverkusen, Germania) 10 mg/kg BW i.p. și atașat dorsal pe un tampon de încălzire la 37 ° C. Alternativ, șoarecii au fost anesteziați prin inhalarea enfluranului (Baxter, Unterschleißheim, Germania) și analgezie utilizând metamizol (Novalgin, Ratiopharm, Ulm, Germania) 200 mg/kg BW i.p. După dezinfectarea pielii, o incizie în jurul celui de-al patrulea mamelon a fost făcută de foarfece mici. Pielea și mamelonul au fost îndepărtate împreună cu o regiune care conține cea mai apropiată parte a tamponului de grăsime și a anlajului mamar. Incizia a fost închisă cu ajutorul unei cleme Michel, care a fost îndepărtată la două săptămâni după operație.

Izolarea celulelor epiteliale mamare primare

Celulele epiteliale mamare primare au fost izolate prin excizia glandelor mamare de la șoareci virgini de 8-12 săptămâni. Întregul tampon de grăsime mamară care conține celulele epiteliale a fost tăiat în bucăți mici și digerat folosind DMEM/F12 mediu 1: 1 cu colagenază (Roche, Basel, Elveția) și hialuronidază (Sigma, München, Germania). După 3 ore de digestie, țesutul a fost spălat de mai multe ori în soluție salină tampon fosfat (PBS) conținând 1% ser de vițel fetal (FCS), celulele au fost colectate prin sedimentare și placate pe plăci de cultură celulară acoperite cu colagen în mediu DMEM/F12 conținând 5 % FCS, 1% glutamină, factor de creștere epidermică și insulină (Sigma). Celulele au fost cultivate timp de trei zile înainte de a fi tripsinizate și utilizate pentru transplant.

Implantarea

Implantul fie de țesut mamar, fie de celule cultivate a fost introdus sau injectat în tamponul de grăsime rămas. S-au folosit fie țesut mamar primar, fie celule unice (1 × 104 celule în 10 μL PBS) de la șoareci femele BALB/c sau C57BL/6 pentru implantare în destinatarul eliberat. Pentru a distinge celulele epiteliale mamare derivate de la gazdă de cele derivate din populația de celule transplantate, celulele epiteliale mamare de la animalele transgenice care poartă gena EGFP (C57BL/6Tg (ACTB-EGFP) Osb) (Laboratoarele Jackson) (Okabe și colab. 1997) au fost folosite ca donatori.

Monturi întregi

A fost efectuată analiza morfologică a țesutului glandei mamare. Glandele mamare întregi, inclusiv tampoanele de grăsime, au fost fixate cu 4% formaldehidă în PBS pe lamele de sticlă și colorate cu hematoxilină timp de 8 ore. După colorare, lamele au fost clătite în apă timp de 15 min. Întreaga montură a fost deshidratată în concentrații scăzute de etanol înainte de eliminarea în xilen și montate cu Euckit (Merck, Darmstadt, Germania).

Țesutul de la animale implantate cu celule pozitive EGFP a fost nativ și analizat la microscopul de fluorescență. Țesutul care exprimă EGFP a fost detectat la o lungime de undă de 488 nm pentru excitație și emisie de 509 nm.

Rezultate

Prezentare generală a metodei

Metoda noastră minimizează invazivitatea procedurii de eliminare a tamponului de grăsime mamară (Figurile 1d - f). În primul rând, mamelonul glandei mamare numărul 4 este identificat și marcat (Figura 2a). O incizie este făcută în jurul mamelonului (Figura 1d) și o parte a tamponului de grăsime este trasă prin incizie (Figurile 1e și 2b). Mamelonul și porțiunea glandei care se extinde până la ganglionul limfatic sunt excizate. Această excizie este importantă din două motive. Primul este că celulele epiteliale contaminante din apropierea mamelonului și arborele ductal alungitor sunt îndepărtate (figurile 3a, b). Al doilea motiv este că legătura dintre glanda a patra și a cincea este întreruptă de excizie. În acest moment, în timpul intervenției chirurgicale, materialul poate fi transplantat în tamponul de grăsime rămas (Figura 1e). Incizia mică poate fi ușor închisă (Figura 1f).

Figura 2 Îndepărtarea anlagei mamare utilizând noua metodă. (a) Al patrulea mamelon mamar marcat cu negru în pregătirea intervenției chirurgicale. (b) Rezecția pielii care conține mamelonul și fixarea tamponului de grăsime cu anlajul mamar. Porțiunea expusă a glandei mamare va fi excizată pentru a elimina porțiunea epitelială a glandei. Rețineți incizia foarte mică și faptul că pielea nu trebuie fixată în loc pentru a expune glanda, așa cum este necesar în procedura clasică.

Figura 3 Examinarea histologică a monturilor glandei mamare. (a, b) Explante (anlage mamar) îndepărtate în timpul intervenției chirurgicale și colorate cu hematoxilină. Descoperirea inițială a arborelui ductal al glandei pubertare timpurii este detectabilă. (c) Suport întreg de tampon de grăsime curățat la șase săptămâni după eliminare. (d) Vedere mărită a tamponului de grăsime curățat. (e) Celulele primare ale șoarecilor transgenici cu proteină fluorescentă verde îmbunătățită (EGFP) au fost implantate în tamponul de grăsime curățat al șoarecilor de tip sălbatic, iar glanda mamară regenerată rezultată a puilor prezintă structuri ductale fluorescente. (f) Sarcina induce țesutul EGFP transplantat să formeze alveole

Succesul metodei de transplant

Modificarea noastră a metodei de eliminare a tamponului de grăsime a produs cu succes tampoane de grăsime mamară curățate de țesut epitelial endogen (Figurile 3c, d). Dezvoltarea ulterioară a țesutului epitelial mamar donator în tamponul de grăsime mamară gazdă a fost foarte similară cu rezultatele descrise de DeOme și colab. (1959). Când glandele mamare eliminate au fost analizate la șase săptămâni până la trei luni după implantare, țesutul epitelial mamar endogen contaminant nu a fost detectat la 125 din 130 de animale eliminate (96%), indicând o rată foarte bună de eliminare.

Pentru a distinge fără îndoială celulele epiteliale mamare endogene și transplantate, am folosit celule primare de la animale transgenice EGFP pentru implantarea în tampoane de grăsime mamară curățate de șoareci de tip sălbatic. Am analizat capacitatea EGFP care exprimă celulele epiteliale mamare de a repopula tamponul de grăsime utilizând microscopia cu fluorescență. Transplantul de celule care exprimă EGFP într-un strat de grăsime curățat a arătat repopularea cu succes a stratului de grăsime, inclusiv structuri ductale în glanda non-gravidă (Figura 3e) și alveolele induse de sarcină (Figura 3f).

Bunăstarea animalelor

Procedura noastră este mai puțin dăunătoare bunăstării animalelor. Nu am observat complicații în timpul vindecării rănilor după operație. Pentru a determina amploarea aderenței țesuturilor, am efectuat disecție după intervenție chirurgicală. Am observat că aderențele legate de cicatrici după operație nu au fost găsite folosind protocolul nostru (datele nu sunt prezentate), dar au putut fi văzute cu metoda clasică.

Datorită invazivității minime a procedurii noastre și a perioadei scurte de timp necesare pentru intervenția chirurgicală, aproximativ 5 minute de la intrarea în vigoare a anesteziei, comparativ cu 25 de minute pentru procedura clasică, s-ar putea aplica anestezia prin inhalare. În consecință, animalele tinere au avut o perioadă de recuperare mai scurtă după operație. Timpul de recuperare prin utilizarea analgeziei injectate și a anesteziei prin inhalare a fost de 2-3 minute. În aceste condiții, nu au apărut decese din cauza complicațiilor anesteziei. Anestezia injectată intraperitoneal necesită un timp îndelungat de recuperare până când medicamentele sunt eliminate și este însoțită de acceptarea redusă a puilor de către mamă. Am observat mai puține probleme cu acceptarea puilor folosind o expunere mai scurtă la medicamente și incizii cutanate mai mici.

Discuţie

Transplantul de glandă mamară este o metodă larg stabilită pentru testarea capacității de dezvoltare a celulelor și țesuturilor mamare in vivo. Pentru a obține plăci de grăsime mamare complet curățate, este necesar să lucrați cu animale cu vârsta cuprinsă între 2,5 și 3,5 săptămâni, în funcție de tulpina șoarecelui, în care excrescența arborelui ductal este încă foarte limitată. Această vârstă fragedă se adaugă la complicația intervenției chirurgicale. Procedura inițială necesită o incizie mare și un timp mai lung de tratament cu anestezie. Poziția subcutanată a tamponului de grăsime mamară permite în mod natural o abordare modificată care reduce dimensiunea inciziei, menținând în același timp clearance-ul cu succes și ușurința transplantului. Această procedură modificată este, de asemenea, extrem de practică și poate fi efectuată rapid, ceea ce devine important atunci când aveți de-a face cu un număr mare de șoareci.

Ambele metode pregătesc tamponul de grăsime mamară ca un mic mediu pentru celulele epiteliale mamare și ambele intervenții chirurgicale duc în continuare la distrugerea canalului excretor mediu. Presiunea crescândă produsă în țesut în timpul alăptării duce la apoptoza celulelor secretoare și la involuția glandei mamare regenerate.

Procedura clasică de curățare a tampoanelor de grăsime a fost relativ nemodificată de la prima descriere din 1959. Modificarea noastră asigură o procedură mai rapidă, reduce dimensiunea inciziei și asigură un timp de recuperare mai rapid al șoarecilor. Face posibilă utilizarea șoarecilor la vârsta de două săptămâni, dacă este necesar, și returnarea lor cu succes mamei. O intervenție chirurgicală care are ca rezultat o incizie mare închisă cu trei sau patru agrafe sau cu o sutură, are ca rezultat adesea respingerea sau ingestia puilor de către mamă. Acest lucru duce la utilizarea șoarecilor mai în vârstă cu o vârstă mai mare de trei săptămâni și o rată de clearance complet mai mică, datorită alungirii ductale care apare la puii mai în vârstă. Clearance-ul incomplet este mai mare la șoarecii cu vârsta cuprinsă între 21 și 28 de zile decât la animalele cu vârsta cuprinsă între 14 și 21 de zile.

Am stabilit o modificare a procedurii de eliminare a tamponului de grăsime care reduce efectele unei intervenții chirurgicale intensive. Metoda este eficientă în timp, permite utilizarea anesteziei pe termen scurt și permite utilizarea șoarecilor foarte tineri care pot fi înapoiați cu succes mamelor care alăptează.

Confirmare

Consiliul de Cercetări în Științe Naturale și Inginerie din Canada a finanțat o parte din această lucrare.