Divizia de afiliere a bolilor digestive, Facultatea de Medicină David Geffen de la Universitatea California din Los Angeles, Los Angeles, California, Statele Unite ale Americii

promovează

Divizia de afiliere a bolilor digestive, Facultatea de Medicină David Geffen de la Universitatea California din Los Angeles, Los Angeles, California, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor digestive, Facultatea de Medicină David Geffen de la Universitatea California din Los Angeles, Los Angeles, California, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor digestive, Facultatea de Medicină David Geffen de la Universitatea California din Los Angeles, Los Angeles, California, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor digestive, Facultatea de Medicină David Geffen de la Universitatea California din Los Angeles, Los Angeles, California, Statele Unite ale Americii

Adresa actuală: Ferring Pharmaceuticals Inc., Parsippany, New Jersey, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor digestive, Facultatea de Medicină David Geffen de la Universitatea California din Los Angeles, Los Angeles, California, Statele Unite ale Americii

  • Iina Tuominen,
  • Leina Al-Rabadi,
  • Dimitris Stavrakis,
  • Iordanis Karagiannides,
  • Charalabos Pothoulakis,
  • James M. Boogie

Cifre

Abstract

Citare: Tuominen I, Al-Rabadi L, Stavrakis D, Karagiannides I, Pothoulakis C, Bugni JM (2013) Obezitatea indusă de dietă promovează dezvoltarea tumorilor de colon la șoarecii tratați cu azoximetan. PLOS ONE 8 (4): e60939. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060939

Editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Statele Unite ale Americii

Primit: 21 decembrie 2012; Admis: 5 martie 2013; Publicat: 3 aprilie 2013

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută financiar de Institutele Naționale de Sănătate (RO-1 DK60729, CP), CURE (New Investigator Award: Digestive Diseases Research Center 41301, JMB), Martin Blinder Fund for IBD Research (CP) și Sigrid Juselius Fundație (bursă postdoctorală, IT). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Obezitatea este o epidemie mondială și predispune puternic la mai multe stări de boală diverse, inclusiv la cancer. Obezitatea, așa cum este estimată prin indicele de masă corporală (IMC), este corelată semnificativ cu riscul crescut de cancer multiplu, inclusiv cu cele ale esofagului, tiroidei, colonului, rinichilor, endometrului și vezicii biliare [1]. Important, riscul de cancer de colon crește dramatic cu IMC, deoarece fiecare creștere treptată de 5 kg/m2 este asociată cu o creștere cu 18% a riscului de cancer [2] și o creștere comparabilă a riscului de adenom [3].

Deoarece obezitatea este asociată cu un consum mai mare de grăsimi și lipide dietetice care pot afecta dezvoltarea cancerului de colon independent de adipozitate, este dificil să separați acești factori epidemiologic și empiric. Componentele unui HFD și tipul de acizi grași consumați au efecte puternice asupra tumorigenezei colonului, sugerând că acestea pot influența direct riscul de cancer [12]. Mecanismele prin care diferite grăsimi alimentare cresc carcinogeneza colonului independent de adipozitate nu sunt pe deplin înțelese, dar pot implica efecte asupra expresiei oncogene în mucoasa colonică [12], [13], secreția de acizi biliari [14] sau stresul oxidativ din hiperoxidabil trigliceride [15].

Studiile de carcinogeneză chimică pe modele murine arată, în general, un efect de creștere a tumorii al hrănirii cu HFD și al obezității asociate [14], [16]. O dietă în stil occidental bogată în grăsimi și săracă în mai mulți nutrienți cheie poate crește formarea tumorii chiar și fără tratament cancerigen [17]. Mai mult, modelele genetice de șoarece sugerează că obezitatea care se dezvoltă fără hrănirea cu HFD duce la promovarea tumorii. De exemplu, atât șoarecii cu deficiență de leptină (ob/ob), cât și șoarecii cu deficit de receptor de leptină (db/db) prezintă o sensibilitate crescută la dezvoltarea tumorilor de colon [7], [18]. Aceste animale suferă de anomalii imune și hormonale care pot confunda efectul excesului de țesut adipos asupra carcinogenezei. Modelele PART oglindesc în mod ideal obezitatea umană și sindromul metabolic. De obicei, aceștia au același element de confuzie decât studiile la om - posibilele efecte independente ale grăsimilor dietetice asupra celulelor epiteliale colonice și a funcțiilor metabolice.

Am adoptat o abordare nouă pentru a determina efectele obezității, fără HFD în curs, asupra dezvoltării tumorii de colon. După inducerea obezității cu HFD, șoarecilor li s-a administrat o dietă regulată înainte de tratarea cu azoximetan (AOM) pentru a induce tumori de colon. Prin urmare, pe parcursul întregii perioade cancerigene, acești șoareci au urmat aceeași dietă cu șoarecii martor și, totuși, atât incidența, cât și multiplicitatea adenoamelor colonice au fost semnificativ crescute. Acesta este primul studiu care arată că obezitatea în sine îmbunătățește dezvoltarea tumorii de colon, fără efectele confundante ale HFD în curs sau ale perturbării genetice.

Metode

Hrănirea și tratamentul cu azoximetan (AOM)

Declarație de etică

Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de cercetare animală al cancelarului de la Universitatea din California, Los Angeles (ARC # 08-127). Studiul a fost realizat conform recomandărilor din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Institutele Naționale de Sănătate. Animalele au fost eutanasiate uman cu inhalarea CO2 urmată de luxația colului uterin.

Conținutul de grăsime corporală

Înainte de eutanasie, grăsimea corporală și masa corporală slabă au fost măsurate cu ajutorul unui analizor de compoziție a întregului corp EchoMRI.

PCR cantitativă

Coloanele de șoareci sacrificați la o zi după doza finală de AOM au fost disecate și bucăți din colonul mediu au fost congelate rapid în azot lichid. ARN-ul a fost preparat printr-o metodă în doi pași utilizând Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) și mini coloane RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Primul ADNc catenar a fost sintetizat folosind kitul de sinteză SuperScript III First-Strand preparat cu hexameri aleatori și expresia genelor a fost evaluată folosind chimia TaqMan, mașina PCR în timp real aplicată Biosystems 7500 și următorii primeri: TNF-α (Mm00443260_g1), IFN -γ (Mm01168134_m1), IL-6 (Mm00446190_m1) și IL-1β (Mm00434228_m1) (AB, Foster City, CA).

Imunohistochimie și scorul apoptozei

Coloanele de la șoareci sacrificați la o zi după doza finală de AOM au fost fixate în formalină timp de 16 ore și încorporate în parafină. Secțiunile transversale din cel puțin 3 piese diferite din colonul mediu au fost colorate cu H&E. Apoptoza a fost marcată în jumătatea inferioară a criptei prin caracteristicile morfologice ale condensării nucleare, fragmentării nucleare și hemoragiei citoplasmatice. Proliferarea a fost evaluată prin colorare Ki67 folosind kitul Vectastain ABC și reactivul Vector DAB conform instrucțiunilor producătorului (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Lungimile zonelor proliferative Ki67-pozitive au fost măsurate utilizând software-ul Zeiss AxioVision. Atât pentru apoptoză cât și pentru lungimile zonei proliferative, au fost punctate cel puțin 100 de cripte în total din trei secțiuni.

analize statistice

Comparațiile în perechi ale multiplicității tumorilor, lungimile zonei proliferative și apoptoza au fost comparate statistic folosind testul non-parametric Mann-Whitney și comparația în perechi a incidenței tumorii utilizând testul exact al lui Fisher. Analiza PCR în timp real a expresiei genelor a fost testată folosind ANOVA bidirecțională. Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul GraphPad Prism (San Diego, CA).

Rezultate

Creșterea indusă de dietă a greutății corporale și a conținutului de grăsime corporală promovează dezvoltarea tumorii

Pentru a determina efectul obezității, fără efectul confuz al HFD în curs, asupra dezvoltării tumorii de colon, am proiectat patru grupuri experimentale de hrănire/tratament cancerigen (Fig. 1A). Pe parcursul întregii perioade cancerigene (tratament AOM și după aceea) șoarecii din grupul HR și R au fost ambii la aceeași dietă obișnuită, iar șoarecii din grupul H și RH au fost ambii cu HFD. După 8 săptămâni fie cu HFD, fie cu dietă obișnuită, șoarecii din grupul HR au avut greutăți comparabile cu cele din grupul H (Fig. 1B). În mod similar, șoarecii din RH au avut greutăți comparabile cu cele din grupul R. Șoarecii din grupul HR au pierdut cea mai mare greutate (25%) în timpul tratamentului cu AOM și au atins aceeași greutate ca șoarecii din grupul R la 9 săptămâni după schimbarea dietei. Șoarecii din grupul RH s-au îngrășat în timpul și după tratamentul cu AOM, dar au cântărit mai puțin decât cei din grupul H pe tot parcursul studiului (Fig. 1B). Deși șoarecii din grupul HR au avut doar o greutate puțin mai mare decât șoarecii din grupul R la o zi după tratamentul cu AOM, conținutul lor de grăsime corporală a fost de 1,38 ori mai mare (Fig. 1C), determinat de Echo RMN. Șoarecii din grupul RH și H au avut procente de grăsime corporală de 1,81 ori respectiv 2,89 ori mai mari decât șoarecii din grupul R după tratamentul cu AOM (Fig. 1C), iar la sfârșitul studiului au avut 2,23 ori și 3,05 ori conținut mai mare de grăsime corporală, respectiv, decât șoarecii R (Fig. 1D).

Reprezentarea schematică a obezității induse de dietă (DIO) și a inducției tumorale odată cu vârsta animalului (A). Greutatea corporală medie este prezentată pentru toate grupurile de șoareci cu timpul 0 care reflectă timpul în care dietele au fost schimbate în grupurile RH și HR, așa cum este descris în metode. Perioada de 5 tratamente AOM săptămânale este prezentată pe axa x (B). Procentul din greutatea corporală constituit din grăsime a fost măsurat prin Echo RMN pentru animalele eutanasiate la 1 zi după ultimul tratament AOM (5 animale pe grup) și vârsta a corespuns animalelor netratate care au primit același regim alimentar (2 sau 3 animale pe grup) (C) . Aceleași măsurători au fost făcute pentru animalele tratate cu AOM la 23 de săptămâni după tratamentul final cu AOM (8 animale pe grup) (D).

Marea majoritate a șoarecilor care urmează o dietă obișnuită (grupul R) nu au dezvoltat adenoame cu doar 1/15 (0,07) animale care dezvoltă un singur adenom (Fig. 2A), în conformitate cu studiile anterioare care arată că tulpina C57BL6/J este relativ rezistent la carcinogeneza indusă de AOM [19]. Incidența tumorii a fost crescută la toate grupurile care au primit HFD: 5/15 (0,33) în H, 5/14 (0,36) în HR și 6/13 (0,46) în HR; cu o creștere semnificativă a HR față de R (P Figura 2. Obezitatea și HFD sporesc dezvoltarea tumorii de colon.

Tumorile colonice au fost marcate la 23 de săptămâni după tratamentul final cu AOM și sunt prezentate numerele observate prin stereomicroscopie (A). Dimensiunile tumorilor au fost măsurate cu un reticul ocular calibrat și sunt prezentate în grupul din (B). ACF per animal este indicat în (C).

Apoptoza și proliferarea criptelor induse de AOM sunt crescute la șoarecii trecuți de la o dietă bogată în grăsimi la o dietă obișnuită

Animalele au fost sacrificate 24 de ore după tratamentul final cu AOM și apoptoza a fost notată în secțiunile colorate cu H&E prin următoarele caracteristici histologice: sângerare citoplasmatică, condensare nucleară și fragmentare nucleară. Un corp apoptotic reprezentativ este indicat de o săgeată albă în (A). Numărul și abaterea standard a apoptozelor per criptă sunt prezentate pentru fiecare animal (B). Lungimea zonei proliferative a fost determinată de colorarea Ki67. O criptă reprezentativă cu o bară de măsurare a software-ului AxioPhot este prezentată în (C). Lungimea medie a zonei proliferative pe animal este prezentată în (D).

Tratamentul AOM induce expresia IFN-γ în colon, indiferent de dietă

Expresia genică a 4 citokine, TNF-α, IL-6, IFN-γ și IL-1β, a fost măsurată în ARN izolat din colonul total 24 de ore după tratamentul final cu AOM (5 animale pe grup) și vârsta a corespuns animalelor netratate care au primit același regim alimentar (2 sau 3 animale pe grup). Sunt afișate valorile relative ale expresiei (medie +/− st. Dev).

Discuţie

În timp ce nu am observat diferențe de expresie a colonului în citokinele inflamatorii la nivelul ARNm, este posibil ca diferite adipokine, hormoni și citokine pro-inflamatorii să fie potențiali mediatori ai efectului obezității asupra dezvoltării cancerului de colon. Studiile efectuate pe șoareci utilizând DIO au arătat o expresie crescută a TNF-a colonului la animalele hrănite cu HFD [22], [35]. Liu și colab. a raportat că HFD timp de 12 săptămâni, fără tratament cancerigen, a crescut expresia TNF-a colonică cu 72% [22]. Ding și colab. a raportat o creștere a expresiei TNF-α ileală, mai degrabă decât colonică, după hrănirea HFD, care a precedat hiperinsulinemia și creșterea în greutate [23]. IL-6 s-a dovedit a fi reglat în sus în colonul distal după alimentarea cu HFD [16]. Într-un studiu realizat de Mentor-Marcel și colab. (2009), diferite citokine pro-inflamatorii, inclusiv IL-6 și IFN-γ au fost crescute în serul șoarecilor ob/ob în stadiile pre-maligne, dar nu avansate ale dezvoltării tumorii de colon induse de AOM [24]. Mai mult, nivelurile de IL-6 au fost reduse la aceste animale la intervenția dietetică, atât în ​​ser, cât și în mucoasa colonică [24]. Pe lângă citokinele pro-inflamatorii, nivelurile ridicate de insulină, care pot stimula semnalizarea pro-supraviețuire și creșterea în celulele epiteliale, sunt un candidat cheie pentru medierea efectului obezității asupra dezvoltării cancerului de colon [10].

Pe scurt, toți șoarecii care au fost hrăniți cu HFD au arătat o creștere a numărului de adenoame, în special cele trecute de la HFD la dieta obișnuită înainte de expunerea la cancerigeni. Prin urmare, acest studiu demonstrează că obezitatea anterioară indusă de HFD, chiar și fără HFD menținută și creșterea în greutate, promovează dezvoltarea tumorilor de colon. Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina rolurile respective ale diferitelor adipokine, hormoni și citokine în acest proces complex.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: JMB CP. Realizarea experimentelor: JMB IT LA DS IK. Analiza datelor: JMB IT. Am scris lucrarea: JMB IT. A contribuit la conținutul intelectual și a aprobat versiunea finală: IT LA DS IK CP JMB.