Departamentul de Științe Fiziologice, Școala de Medicină din Virginia de Est, Norfolk, Virginia 23507

sării

Departamentul de Științe Fiziologice, Școala de Medicină din Virginia de Est, Norfolk, Virginia 23507

Departamentul de Științe Fiziologice, Școala de Medicină din Virginia de Est, Norfolk, Virginia 23507

Departamentul de Științe Fiziologice, Școala de Medicină din Virginia de Est, Norfolk, Virginia 23507

Abstract

Animale

Toate procedurile care implică animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Eastern Virginia Medical School. Optsprezece șobolani masculi SD (300-350 g) cușcați individual au fost selectați aleatoriu pentru a fi hrăniți cu o dietă moderat bogată în grăsimi (MHF) cu sodiu 0,8% (32% kcal ca grăsime, Research Diets, New Brunswick, NJ), în timp ce șase șobolani (martorii) au fost hrăniți cu dietă purificată cu conținut scăzut de grăsimi (LF) cu sodiu 0,8% (10,6% kcal ca grăsime, Research Diets) timp de 10 săptămâni. Un număr identic de șobolani a fost plasat pe dietele MHF și LF, fiecare conținând fie 2 sau 4% sodiu (diete bogate în sare). Hrana și apa au fost furnizate ad libitum pe tot parcursul experimentului. Greutățile corporale (BW) și lungimile au fost măsurate inițial și apoi săptămânal împreună cu aportul de alimente. Șobolanii hrăniți cu dieta MHF atât cu sare scăzută, cât și cu conținut ridicat de sare s-au divizat în grupuri distincte pe baza câștigurilor BW. Atribuirea șobolanilor în obezitate (OP) (n = 8) și rezistent la obezitate (OR)n = 8) grupurile au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (12).

TA sistolică

Debutul și dezvoltarea hipertensiunii arteriale au fost evaluate prin utilizarea metodei manșetei cozii cu un Narco Biosystems Electro-Sphygnomanometer (Houston, TX). TA a fost măsurată în condiții conștiente la începutul experimentului și la 1, 5, 8 și 10 săptămâni de dietă. Pentru fiecare măsurare s-a înregistrat media a cinci citiri de presiune.

Evaluarea stresului oxidativ

Producția de anion superoxid a fost măsurată în inele aortice izolate folosind o metodă descrisă anterior (12, 21). Pe scurt, inelele aortice de 5 mm au fost preincubate în tampon Krebs-bicarbonat, la 37 ° C, timp de 30 de minute și apoi transferate într-un cocktail conținând 5 μmol/l de lucigenină și măsurate imediat, la fiecare 2 minute, timp de 15 minute în total, folosind un contor scintilație setat în modul în afara coincidenței. Citirile au fost reprezentate grafic și zona de sub curbă a fost integrată. Rezultatele au fost normalizate pe miligram de ADN măsurat folosind colorantul Hoechst 33258 așa cum este descris (27). Specificitatea reacției a fost testată prin capacitatea a 50 U/ml de SOD de a stinge chemiluminescența la sfârșitul măsurării.

Gratuit 8-izoprostan F2α. Isoprostanii au fost măsurați prin EIA utilizând un kit de la Cayman Chemicals așa cum s-a descris anterior (12). Urina colectată în cuști metabolice pe o perioadă de 24 de ore a fost suplimentată cu 0,05% butilat hidroxitoluen și înțepată cu 8- [3H] izoprostan. Probele (1 ml) au fost trecute pe o coloană de afinitate (Cayman Chemicals) și numai izoprostanii liberi au fost eluați folosind 95% metanol. Eluatul a fost evaporat la sec sub un curent de N2 și peleta a fost resuspendată într-un tampon de testare de 1 ml. Fiecare probă a fost testată în duplicat la două diluții diferite și corectată pentru recuperarea individuală a 8- [3H] izoprostanului, iar rezultatele au fost mediate. Nitratul/nitritul a fost testat atât în ​​plasmă, cât și în urină (diluat 1:50 în PBS) utilizând o metodă colorimetrică LDH cu un kit de la Cayman Chemicals.

Imunohistochimie pentru 4-hidroxi-2-nonenal. Rinichii au fost fixați în 10% formalină tamponată timp de 3 ore și parafină încorporată. Secțiunile au fost incubate cu un anticorp policlonal recunoscând 1: 1 aducti Cys, His, Lys-4 hidroxi-2-nonenali „Michael” (Calbiochem, diluție 1: 750). Diapozitivele au fost apoi reacționate cu anticorp anti-iepure biotinilat de capră (diluție 1: 500; Vector Laboratories, Burlin-game, CA), cu reactivul ABC-Elite avidin (Vector Laboratories) și, în cele din urmă, cu Immuno Pure Metal Enhanced DAB Set de substrat (Pierce, Rockford, IL).

Hipertrofie vasculară și scleroză renală

Zona peretelui aortic. Secțiunile subțiri ale țesutului încorporat în parafină au fost colorate timp de 1 min cu albastru de toluidină și analizate așa cum s-a descris anterior (10).

Histologie renală. Rinichii au fost fixați în 10% formalină tamponată timp de 4 ore și încorporate în parafină. Secțiunile au fost colorate folosind reactivul periodic acid-Schiff (PAS) și contracolorate cu hematoxilină. Pentru a evalua gradul de scleroză segmentară, trei anchetatori independenți au examinat diapozitivele într-o manieră oarbă, amestecând diapozitivele după acoperirea numerelor de protocol. În fiecare caz, 80-100 glomeruli au fost examinați pentru fiecare lamă și clasificați individual pe o scară de la 0 la 2+ în funcție de gradul de scleroză glomerulară. Gradul 0 era un glomerul cu aspect normal; gradul 1+ s-a caracterizat printr-o expansiune ușoară a matricei mezangiale, fără ocluzie în capilarele glomerulare sau aderență la capsula Bowman; și gradul 2+ a inclus extinderea matricei mezangiale, de obicei focală cu aderență la capsula Bowman și un anumit grad de ocluzie capilară. S-a obținut un scor reprezentând suma notelor pentru fiecare șobolan.

Morfometrie adipocitară

Țesuturile adipoase din același depozit și grup au fost reunite și colagenaza a fost digerată în conformitate cu Rodbell și Krishna (39). Adipocitele au fost spălate de mai multe ori pentru a îndepărta colagenaza și centrifugate pentru a separa adipocitele de preadipocite, celule stromale și membrane vasculare. Diametrul celulei de ~ 1200 celule a fost măsurat cu sistemul de analiză Image 1 (Universal Image, West Chester, PA). Diametrul mediu al celulei a fost utilizat pentru a estima volumul mediu al celulei. Mărimea celulei (μg lipidă/celulă) a fost calculată prin înmulțirea volumului celulei (pl) cu densitatea lipidelor (~ 0,915 g/ml). Conținutul de lipide celulare a fost determinat conform metodei Dole (14). Conținutul de lipide celulare și dimensiunea celulei au fost utilizate pentru a calcula numărul celulei.

Statistici

Datele sunt mijloace ± SE. Pentru a determina semnificația între diferite grupuri, s-a efectuat ANOVA în două sau trei direcții urmat de testul post hoc al lui Tukey. P

tabelul 1. BW și adipozitate la șobolani OP, OR și C pe diete de 0,8, 2 și 4% NaCl

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE; n = 6 șobolani/grup. Indicele de obezitate a fost calculat prin împărțirea rădăcinii cubice a greutății corporale (BW; g) la lungimea nazală (mm) × 10 4. * Semnificativ vs. rezistent la obezitate (OR) și control (C). OP, predispus la obezitate (P

FIG. 1.Consumul mediu zilnic de alimente în grupuri predispuse la obezitate (OP), rezistente la obezitate (OR) și control (C) pe 2% NaClA) și 4% NaCI (B) comparativ cu 0,8% grupe NaCl. Consumul de alimente a fost măsurat săptămânal și corectat pentru scurgeri pentru fiecare șobolan individual. Cantitatea medie pe zi a fost reprezentată grafic pentru săptămâna când a fost măsurată și tensiunea arterială sistolică. * Semnificativ în comparație cu SA din același grup de sare (P

masa 2. Efectul sării asupra parametrilor adipocitelor și asupra producției de leptină la șobolanii OP, OR și C.

Datele sunt medii ± SE de 3-4 șobolani/grup pentru morfometria adipocitelor și n = 6 șobolani/grup pentru datele despre leptină. Diametrul celulei de ~ 1200 celule (~ 200 celule · tampon de grăsime -1 · șobolan -1) a fost măsurat și utilizat pentru a calcula volumul celulelor și dimensiunea celulei; conținutul de lipide celulare a fost utilizat pentru a calcula numărul de celule. Diametrul mediu al celulei a fost utilizat pentru a estima volumul mediu al celulei. Mărimea celulei (μg lipidă/celulă) a fost calculată prin înmulțirea volumului celulei (pl) cu densitatea lipidelor (~ 0,915 g/ml). n.d., Nedeterminat. * Semnificativ în comparație cu 0,8% NaCl. † Semnificativ în comparație cu OR. ‡ Semnificativ în comparație cu C. Toate P

FIG. 2.Tensiunea arterială sistolică (TA) în OP, OR și C pe 2% NaClA) și 4% NaCI (B) comparativ cu dietele de NaCl de 0,8%. TA sistolică a fost monitorizată de la începutul studiului folosind metoda coșului. Șobolanii OP cu sare bogată au crescut semnificativ TA, începând cu săptămâna 5, întrucât șobolanii OP pe sare obișnuită sunt hipertensivi începând cu săptămâna 8 pe dietă. Activitatea reninei plasmatice (C) a fost măsurată în probe de plasmă terminale de la șobolani OP, OR și C pe 0,8% NaCl, 2% NaCl și 4% NaCl, utilizând o metodă RIA. Datele reprezintă media ± SE de 6 șobolani/grup. * Semnificativ în comparație cu grupurile OR și C; #semnificativ în comparație cu omologul de 2% sare; * semnificativ în comparație cu omologul de 4% sare (P

Stresul oxidativ la șobolani alimentați cu diete regulate și bogate în sare

FIG. 3.Izoprostane urinare gratuite (A), generarea de superoxid aortic (B) și excreția de nitrați/nitriți (C) la șobolani OP, OR și C pe diete NaCl 0,8%, NaCl 2% și NaCl 4%. Izoprostanii fără urină au fost măsurați utilizând o metodă EIA. În ambele grupuri de OP pe dietă cu conținut ridicat de Na și regulat, izoprostanii sunt semnificativ crescuți în comparație cu grupurile OR și C respective. Generarea de anioni superoxizi prin inele aortice a fost măsurată prin chemiluminescență lucigenină așa cum este descris în metode. Aportul ridicat de Na induce o creștere a producției de superoxid în grupul OP, dar nu și în OR și C. Excreția de nitrați/nitriți, măsurată printr-o metodă colorimetrică LDH, indică o reducere de aproximativ patru ori a șobolanilor OP atât la săruri regulate, cât și la cele cu conținut ridicat de sare diete, comparativ cu grupurile OR și C. Aportul de sare nu reduce în continuare excreția de nitrați/nitriți. * Semnificativ în comparație cu OR și C; #semnificativ vs. Omolog 2% NaCl; * semnificativ vs. Omolog de 4% NaCl (P

FIG. 4.Colorarea periodică a acidului Schiff (PAS) -hematoxilină a cortexului renal în OP cu conținut ridicat de sare (A), SAU (B) și C (C) șobolani și sare normală OP (D), SAU (E) și C (F) șobolani. Imunohistochimie utilizând un anticorp 2-hidroxi-4 nonenal (HNE) în NaCl OP 4% (G), SAU (H) și C (Eu) șobolani și normal (0,8%) - sare OP.), SAU (K) și C (L) șobolani; controlul metodei folosind ser neimun în locul anticorpului primar (M). Colorarea PAS indică glomeruloscleroza și depunerea crescută a matricei în cortexul șobolanilor OP cu conținut ridicat de sare (A) și într-o măsură mai mică la șobolanii OP pe dieta obișnuită cu sare. De asemenea, colorarea HNE este mai intensă la șobolanii OP, OR și C pe sare mare (G-Eu) vs. sare normală (.-L), cu același model de distribuție. Bară = 10 μm.

Efectul sării asupra hipertrofiei vasculare, a sclerozei renale și a funcției excretoare

FIG. 5.Hipertrofie vasculară (A) și excreția de albumină (B) la șobolani OP, OR și C pe regim normal de sare (0,8%) - și ridicat (2 și 4%). Zona peretelui (A) a fost măsurată pe secțiuni aortice colorate cu albastru de toluidină, cu utilizarea unui sistem de imagine bazat pe video cu software de urmărire a marginilor. Albumină (B) a fost măsurată folosind un kit ELISA în probe de urină de 24 de ore, colectate în cuști metabolice la sfârșitul studiului. Datele reprezintă media ± SE de 6 șobolani/grup. * Semnificativ în comparație cu OR și C; #semnificativ în comparație cu 2% NaCl omolog; * semnificativ în comparație cu 4% NaCl omolog (P

De asemenea, dieta bogată în sare a indus o creștere semnificativă a dimensiunii adipocitelor, în special la șobolanii OP. Hipertrofia adipocitelor poate potența rezistența la insulină la șobolanii OP, datorită efluxului crescut de acizi grași și creșterii trigliceridelor circulante. S-a arătat că sarea crește nivelul circulant al acizilor grași (17), iar datele noastre care indică hipertrofia adipocitelor sugerează o posibilă creștere a acizilor grași circulanți.

Acest studiu a fost susținut de National Institutes of Health Grant HL-54810, un Grant-in-Aid de la American Heart Association (AHA) și o bursă postdoctorală de la MidAtlantic Affiliate a AHA către Dr. A. D. Dobrian.