Afiliere The Open University, Departamentul de Viață, Sănătate și Științe Chimice, Milton Keynes, Regatul Unit

pierderea

Afiliere The Open University, Departamentul de Viață, Sănătate și Științe Chimice, Milton Keynes, Regatul Unit

Universitatea de afiliere din Copenhaga, Departamentul de Neuroștiințe și Farmacologie, Copenhaga, Danemarca

Afiliere The Open University, Departamentul de Viață, Sănătate și Științe Chimice, Milton Keynes, Regatul Unit

Afiliere The Open University, Departamentul de Viață, Sănătate și Științe Chimice, Milton Keynes, Regatul Unit

Universitatea de afiliere din Copenhaga, Departamentul de Neuroștiințe și Farmacologie, Copenhaga, Danemarca

Afiliere The Open University, Departamentul de Viață, Sănătate și Științe Chimice, Milton Keynes, Regatul Unit

  • Nicola J. Corbett,
  • Paul L. Gabbott,
  • Boris Klementiev,
  • Heather A. Davies,
  • Frances M. Colyer,
  • Tatiana Novikova,
  • Michael G. Stewart

Cifre

Abstract

Citare: Corbett NJ, Gabbott PL, Klementiev B, Davies HA, Colyer FM, Novikova T și colab. (2013) Pierderea celulelor piramidale CA1 induse de amiloid-beta la șobolani adulți tineri este ameliorată prin tratament sistemic cu FGL, o peptidă mimetică derivată de molecula de adeziune celulară neuronală. PLoS ONE 8 (8): e71479. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0071479

Editor: Sergio T. Ferreira, Universitatea Federală din Rio de Janeiro, Brazilia

Primit: 8 februarie 2013; Admis: 29 iunie 2013; Publicat: 9 august 2013

Finanțarea: Acest studiu a fost susținut de grantul programului FPVI „Promemoria” al Uniunii Europene (numărul contractului 512012) și de BBSRC. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Patologia bolii Alzheimer (AD) include formarea de plăci amiloide și încurcături neurofibrilare, neuroinflamare [1], deficit de neurotransmițător [2], alterări sinaptice [3] și pierderea celulelor neuronale [4]. S-a observat o scădere a densității și a numărului total de neuroni din cortexul temporal, cortexul frontal [5] - [7], cortexul entorhinal, în special straturile II și IV [8], [9], Nucleus Basalis din Meynert, locus coeruleus [7], [10], cerebel [11] și hipocampus corelat cu atrofia regională în AD [12]. Mann și colab. (1985a) au constatat că în cortexul temporal există o corelație directă între pierderea celulelor neuronale și placa amiloidă și acumularea de încurcături neurofibrilare [13]. Atât în ​​cortexul temporal, cât și în cortexul frontal, Hansen și colab. (1988) au constatat o scădere de 15-18% a densității neuronale în cazurile de stadiu târziu de AD, dar a existat de fapt o pierdere neuronală mai mare (scădere de 23 până la 26%) în etapele timpurii ale AD [14]. Cea mai cunoscută caracteristică a AD, afectarea memoriei (în special memoria episodică și spațială), este corelată cu scăderea volumului hipocampic [15] din cauza disfuncției neuronilor și a sinapselor din CA1 și cortexul entorhinal [16] - [19].

Materiale și metode

Declarație etică

Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu legislația daneză. O licență pentru animale a fost obținută de la inspectoratul danez de experimente pe animale (2001/561-483). Administrarea Aβ25-35 sau a vehiculului a fost efectuată sub anestezie folosind o injecție intraperitoneală (ip) de Hypnorm/Midazolam (23,6 µg fentanil, 0,75 mg fluanizonă, 375 (g midazolam/100 g animal; 0,3 ml/100 g, Pharmacy of the Royal Universitatea Veterinară și Agricolă, Frederiksberg, Danemarca) și s-au depus toate eforturile pentru a minimiza suferința.

Animale experimentale

Șobolani Wistar masculi adulți (300 g la începutul experimentului; Charles River, Sulzfeld, Germania) au fost adăpostiți în cuști (2 pe cușcă) cu acces gratuit la alimente și apă, într-un mediu reglementat (23 ° C, 50% umiditate, ciclu diurn de 12 ore lumină/întuneric). Șobolanii au fost împărțiți în mod egal în 4 grupuri (n = 4; Aβ25-35 + vehicul, Aβ25-35 + FGL, vehicul + FGL, control).

Administrarea intracerebroventriculară de amiloid-beta25-35

Agregatele de Aβ25-35 (Bachem AG, Weil am Rhein, Germania) au fost preparate prin incubarea peptidei la o concentrație de 3 µg/µl în apă distilată timp de 4 zile la 37 ° C înainte de administrare, așa cum a fost descris anterior de Delobette și colab. . (1997) pentru a forma structuri asemănătoare fibrilelor și agregate globulare amporfe [39]. La două luni de la data livrării animalelor, 5 µg/15 µl de Aβ25–35 agregat sau apă distilată ca vehicul au fost i.c.v. injectat (tipul acului seringii fiind de 0,8 mm posterior de bregma, 1,5 mm lateral de sutura sagitală și 3,8 mm sub suprafața creierului) în ventriculul lateral drept folosind o seringă de 10 silici în ziua 0 a experimentului. Aceste injecții au fost administrate între orele 10 și 13, în timpul perioadei ușoare a ciclului.

Administrarea subcutanată a FGLL

FGLL, constând din doi monomeri FGL legați prin acid aminodiacetic prin terminalul lor N, a fost sintetizat de Polypeptide Laboratories (Hillerød, Danemarca) așa cum se menționează în Secher și colab. (2006) [32] și Klementiev și colab. (2007) [21]. 2 ml/kg (10,8 mg/kg) de FGLL s-au dizolvat în 0,5% greutate/volum de ser albumină bovină (BSA; Sigma-Aldrich Company LTD, Gillingham, Marea Britanie) și 0,01 M fosfat salin tampon (PBS, pH 7,4). La șapte zile după i.c.v. injectare și în fiecare a treia zi până la, inclusiv, în ziua 25 a experimentului, fie FGLL, fie 0,5% greutate/volum BSA în 0,01 M PBS, ca vehicul, a fost administrat subcutanat (s.c.) folosind o seringă sterilă de 1 ml. Aceste tratamente au fost administrate și în timpul perioadei ușoare a ciclului, între orele 14.00 și 15.00 fără anestezie.

Secher și colab. (2006) au folosit un test imunosorbent legat de enzime (ELISA) pentru a determina concentrația de FGLL în plasmă și lichidul cefalorahidian (LCR) la șobolani adulți după s.c. administrare [32]. Au descoperit că FGLL a fost detectabil în plasmă și LCR la 10 minute după administrare și a fost încă detectabil până la cinci ore mai târziu, ceea ce sugerează că FGLL este capabil să traverseze bariera hematoencefalică [32]. Hipocampul este o țintă majoră pentru FGL [26], cu fosforilarea FGFR1 în hipocampus care are loc în decurs de o oră de la s.c. administrarea peptidei [42].

Test de memorie de recunoaștere socială

În ziua 24 (cu o zi înainte de tratamentul FGL final), memoria pe termen scurt a fost măsurată folosind testul memoriei de recunoaștere socială [43]. Șobolanii testați au fost plasați în cuști individuale cu 15 minute înainte de introducerea unui nou șobolan mascul Wistar juvenil. Șobolanul minor a fost lăsat în cușcă timp de patru minute și apoi îndepărtat. După un interval de 30 de minute, același șobolan juvenil a fost plasat în cușcă. Timpul necesar pentru investigarea minorului a fost înregistrat în ambele ocazii. Comportamentele de investigație au inclus contactul direct cu inspecția și adulmecarea corpului minorului și, de asemenea, urmărirea atentă a șobolanului minor [43]. Raportul de recunoaștere socială a fost calculat din timpul petrecut în investigarea minorului în timpul fiecărei întâlniri. Dacă șobolanul nu ar avea amintiri despre prima întâlnire, nu ar exista nicio diferență între cele două ori și raportul ar fi 0,50. În timp ce raportul este mai mic, comparativ cu 0,5, cu atât șobolanul a fost mai rapid la recunoașterea minorului în timpul celei de-a doua expuneri.

Perfuzie transcardială și secționarea țesuturilor

Estimarea volumului

Imunohistochimie dublă

Pentru a vizualiza celulele piramidale pentru numărarea celulelor unui anticorp împotriva NeuN, a fost utilizat un marker nuclear împreună cu SG, o pată gri închis. GSK3β inactiv (GSK3βps9) în citoplasma celulelor piramidale din CA1 a fost vizualizat folosind un anticorp împotriva GSK3βps9 împreună cu DAB, o pată maro. O colorare imunopozitivă dublă a fost efectuată pentru a număra numărul de celule piramidale CA1 care conțineau GSK3β inactiv în citoplasmă folosind anticorpi împotriva NeuN și GSK3βps9 cu SG și respectiv DAB. Scară Bară = 40 µm.

Numărul și forma celulei

Analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată pe toate datele folosind SPSS 16.0 pentru Windows (SPSS Inc., Chicago, SUA). S-a efectuat un test t dintr-un eșantion pe rezultatele medii ale testelor de memorie de recunoaștere socială în raport cu raportul 0,5 „fără memorie de recunoaștere”. Un ANOVA unidirecțional urmat de un test Tukey post-hoc a fost utilizat pentru a evalua diferențele semnificative între grupuri pentru toate celelalte rezultate. Nivelul de semnificație statistică a fost luat ca P 0,05, n = 4). Acest lucru indică faptul că numai grupul Aβ25-35 nu a putut să recunoască șobolanul juvenil în timpul celei de-a doua întâlniri, în timp ce celelalte grupuri au recunoscut juvenilul. Acest lucru sugerează că Aβ25-35 cauzează deteriorarea memoriei pe termen scurt; cu toate acestea, atunci când este dată, memoria FGL este salvată.

Un șobolan juvenil necunoscut a fost introdus în cușca șobolanului testat și 30 de minute mai târziu, juvenilul a fost așezat înapoi în cușcă. Ambele perioade de investigație au fost înregistrate și s-a calculat raportul de recunoaștere socială. Un raport de recunoaștere socială de 0,5 nu indică nicio memorie a minorului. Folosind un test t-test, sa constatat că animalele tratate cu Aβ25-35 urmate de FGL, FGL singur sau vehicule (martor) au avut un raport semnificativ mai mic de 0,5 (P 0,05, n = 4). A existat o tendință către o reducere a volumului hipocampului drept, în special în CA1 și subregiunile sale, în grupurile cărora li s-a administrat Aβ25-35 și surprinzător, de asemenea, atunci când animalele au fost tratate cu FGL singur. Volumul regiunii dorsale CA3 a hipocampului drept la animalele martor a fost semnificativ mai mare cu 30% decât în ​​toate celelalte grupuri (figura 3; P 0,05, n = 4). Acest lucru arată că i.c.v. injecția și tratamentul sistemic au avut un efect bilateral egal asupra volumului hipocampului, astfel încât ultima parte a studiului a fost efectuată numai pe hipocampul dorsal drept.

Folosind un test ANOVA unidirecțional și testul post-hoc al lui Tukey, volumul CA3 dorsal din grupul de control a fost semnificativ mai mare decât toate celelalte grupuri (** P Figura 4. Densitatea și numărul total de celule piramidale CA1 din dorsalul drept hipocamp.

a) O secțiune din CA3 de la un șobolan dat doar Aβ25–35, care arată un număr mare de celule piramidale deteriorate (săgeata indică un grup de celule piramidale deteriorate). b) O imagine mărită a casetei într-un. Săgețile indică celule piramidale „deteriorate” cu corpuri celulare dens colorate în albastru de toluidină, concavate. „N” este un exemplu de neuron „sănătos”. Bara de scalare a = 50 µm și b = 20 µm.

Pentru a determina modificările formei și dimensiunii celulei somate a celulelor piramidale CA1 dorsale, 20 de celule pe secțiune au fost urmărite la diametrul maxim „în focalizare”. Nu au existat diferențe semnificative între oricare dintre grupuri în ceea ce privește diametrul maxim și minim. Un raport dintre diametrul maxim și minim poate reprezenta forma structurii. Un raport de 1,0 semnifică o structură sferică și un raport mai mic de 1,0 indică faptul că obiectul are o formă sferoidă prolată [49]. Raportul nu a diferit semnificativ între grupuri. Raportul a variat între 0,67 și 0,69 (P Figura 6. Procentul de celule piramidale CA1 în hipocampul dorsal drept care conține GSK3β inactiv.

Imunocitochimia dublă și metoda fracționatorului optic au fost utilizate pentru a stabili densitatea celulelor piramidale în CA1 și, de asemenea, densitatea celulelor piramidale care conțin GSK3β inactiv. Au fost calculate numerele absolute ale ambelor densități și s-a stabilit procentul tuturor celulelor piramidale CA1 care conțineau GSK3β inactiv. Datele au fost analizate folosind un ANOVA unidirecțional și testul post-hoc al lui Tukey. Șobolanii Aβ25-35 + FGL au avut un procent semnificativ mai mare de neuroni piramidali în CA1 care conținea GSK3β inactiv comparativ cu șobolanii Aβ25-35 singuri. (* P în Veh + FGL> la animalele Aβ + FGL). Rezultatele Aβ25-35 sunt similare cu cele ale lui Arancibia și colab. (2008), care au descoperit că i.c.v. injectarea de Aβ25-35 a cauzat celule piramidale deteriorate în hipocampul dorsal încă din 4 săptămâni după injectarea Aβ25-35 [34]. Rezultatele FGL singure sunt similare cu deteriorarea și pierderea celulelor, iar scăderea volumului observată în studiul de Ojo și colab. (2013) [59]. Acest lucru sugerează că atât Aβ25-35 cât și FGL, atunci când sunt administrate separat, provoacă leziuni ale celulelor piramidale CA3, dar atunci când sunt combinate sunt mai puțin dăunătoare.

Împreună, aceste rezultate susțin ideea că efectele FGL și Aβ25-35 nu sunt specifice CA1, deoarece ambele au efecte asupra CA3; cu toate acestea, ele exercită un efect mai mare asupra CA1 decât CA3, deoarece numai deteriorarea celulelor apare în CA3, în timp ce pierderea completă a celulei are loc în CA1 atunci când ambele sunt administrate singure. Rezultatele Aβ25-35 sunt în acord cu Stepanichev și colab. (2006), care a menționat că i.c.v. administrarea de Aβ25-35 are cel mai mare efect asupra CA1 a hipocampului [36], și cu West și colab. (2000), care au descoperit că CA1 este cea mai vulnerabilă regiune a hipocampului la pierderea neuronală (până la 58% pierderi) la pacienții cu AD [19].

Tratamentul FGL crește proporția celulelor piramidale CA1 care conțin GSK3β inactiv

Se crede că FGL funcționează prin calea FGFR-AkT [24] ducând la inactivarea GSK3β [21]. S-a demonstrat că GSK3β activ cauzează o serie de patologii AD. În studiile AD umane, reglarea crescută a genei GSK3 a fost observată în hipocamp [60]. Se știe că Aβ25-35 crește nivelurile de GSK3β active în neuronii hipocampici [38], [61]. În studiul actual, au existat mai mulți neuroni piramidali CA1 care conțin GSK3β inactiv la animalele cărora li s-a administrat FGL. Acest lucru sugerează că FGL a inhibat activitatea GSK3β. Descoperirile actuale arată, de asemenea, că cea mai semnificativă cantitate de celule piramidale CA1 conținând GSK3β inactiv au fost observate la acele animale cărora li s-a administrat FGL după administrarea Aβ25-35. Acest lucru ar putea fi un rezultat al reglării superioare a expresiei GSK3β indusă de Aβ25-35 în neuroni și, prin urmare, FGL este capabil să inactiveze o cantitate mai mare de GSK3β.

GSK3β este un regulator al apoptozei [62]. Pentru studiul actual, pierderea neuronilor numai de Aβ25-35 ar putea fi rezultatul dereglării GSK3β cu Aβ25-35 promovând apoptoza ca Hu și colab. (2009) au constatat că atunci când oligomerii Aβ au fost administrați șobolanilor, a existat un nivel crescut de colorare a caspazei 3 și TUNEL (un marker de fragmentare a ADN-ului) în CA1, sugerând că a avut loc apoptoză [63]. Se crede că FGL acționează ca un inhibitor GSK3β care se opune efectelor Aβ25-35 și, prin urmare, reglează kinaza și previne apoptoza. Rockenstein și colab. (2007) au arătat că administrarea de litiu (un inhibitor GSK3β) la șoarecii transgenici APP umani poate atenua deficiențele de memorie, proteja structurile dendritice și reduce fosforilarea tau și APP în hipocampul acelor șoareci [64]. Această cale pare a fi cea mai evidentă legătură între FGL și Aβ și modul în care FGL poate fi un agent neuroprotector; cu toate acestea, este important să se stabilească calea exactă a interacțiunii prin intermediul analizei biochimice.

Efectul FGL asupra GSK3β poate explica, de asemenea, efectele dăunătoare observate la hipocampul șobolan adulți tineri sănătoși. Hu și colab. (2009) au raportat descoperiri foarte similare cu un inhibitor GSK3, SB216763 (SB), utilizând modele AD in vitro și in vivo [63]. S-a descoperit că SB protejează neuronii hipocampului primar de șobolan in vitro de toxicitatea oligomerilor Aβ; cu toate acestea, administrarea unei concentrații mari de SB singură a cauzat toxicitate. S-a arătat că oligomerii Aβ in vivo administrați șobolanilor cauzează o activitate crescută a GSK3β, în CA1, în timp ce SB a redus efectiv, dar nu a abolit activitatea GSK3 [63], corelându-se cu prevenirea parțială menționată în prezentul studiu. Similar studiului actual, Hu și colab. (2009) raportează, de asemenea, neuronii deteriorați și neuronii distrofici în CA1, CA3 și DG cu tratament Aβ, care a fost prevenit de SB; în timp ce SB singur a provocat leziuni neuronilor hipocampului [63].

Efectele observate cu FGL și SB s-ar putea datora capacității lor de a inactiva GSK3β. GSK3β activ promovează apoptoza mediată de mitocondrie (apoptoza „intrinsecă”), în timp ce GSK3β inactiv promovează apoptoza mediată de receptor care conține domeniul de moarte (apoptoza „extrinsecă”; după cum este revizuită de [62]). În ambele forme de apoptoză se crede că GSK3β este în amonte de semnalizarea caspază [62]. GSK3β reglează în sus expresia factorilor de transcriere și de traducere și a proteinelor care sunt importante în calea apoptotică și reglează în jos proteinele anti-apoptotice, scăzând pragul pentru apoptoză. Într-o celulă sănătoasă, reglarea GSK3β inhibă apariția oricărei forme de apoptoză [62]. Șoarecii knockout GSK3β mor din cauza leziunilor hepatice cauzate de apoptoza hepatocitelor, în timp ce supraexprimarea GSK3β singură induce apoptoza liniei celulare PC12 derivate din feocromocitom [65].

Acest studiu a demonstrat că i.c.v. injectarea de Aβ25-35 este dăunătoare celulelor piramidale CA1 și CA3, similar cu cea din creierele AD umane, putând duce la afectarea memoriei pe termen scurt. Administrarea unei peptide derivate din NCAM, FGL, a atenuat această patologie și afectarea memoriei. Cu toate acestea, FGL administrat animalelor sănătoase poate fi dăunător hipocampului. Efectele Aβ25-35 și FGL pot fi legate prin GSK3β, permițând FGL să fie benefic în condiții patologice, dar în detrimentul hipocampului sănătos.

Contribuțiile autorului

Conceput și proiectat experimentele: NJC MGS PLG BK. Au efectuat experimentele: NJC PLG MGS BK HAD FMC TN. Analiza datelor: NJC BK. Am scris lucrarea: NJC.