Abstract

  • AT/RT
  • creier
  • cerebel
  • dezvoltare
  • Smarc
  • tumora

Introducere

Materiale și metode

Șoareci transgenici.

Generația de șoareci care poartă un exon 1 flancat loxP al genei Smarcb1 sau o genă Smarca4 flancată loxP a fost descrisă anterior (Roberts și colab., 2002; Indra și colab., 2005). Acești șoareci au fost încrucișați la șoareci Math1-cre (Schüller și colab., 2007) pentru a genera șoareci Math1-cre: Smarcb1 fl/fl și Math1-cre: Smarca4 fl/fl. Șoarecii au fost ținuți în condiții standard. Genotiparea a fost efectuată prin PCR standard utilizând primerii specifici Cre (5'-TCCGGGCTGCCACGACCAA-3 'și 5'-GGCGCGGCAACACCATTTT-3'), primerii specifici Smarcb1 (5'-TAGGCACTGGACATAAGGGC-3 ') și 5'-GATACT și Smarca -primeri specifici (5'-GCCTTGTCTCAAACTGATAAG-3 'și 5'-GTCATACTTATGTCATAGCC-3' și 5'-GATCAGCTCATGCCCTAAGG-3 '). Șoarecii au fost monitorizați intens de două ori pe zi, inclusiv controlul greutății și mărimii.

afectează

Histologie/imunocolorare.

Țesutul încorporat în parafină a fost secționat, deparafinat și rehidratat înainte ca antigenul de recuperare indus de căldură să fie condus la 100 ° C timp de 20 min în tampon citrat de sodiu 10 m m pentru toți anticorpii. Colorarea imunohistochimică s-a făcut folosind anticorpi primari (NeuN, Smarcb1, Calbindin, Cre, fosfo-Histona H3) și sistemul de colorare HRP/DAB (DAKO) conform specificațiilor producătorului. Hemalaun a fost folosit pentru contracolorarea nucleară. Pentru dublu colorare imunofluorescentă, secțiunile au fost spălate de două ori cu PBS/0,1% Triton X-100 și apoi incubate în tampon de blocare (reactiv de blocare pe bază de proteine ​​I-Block; Applied Biosystems) timp de 30 de minute. Anticorpii primari au fost diluați în tampon de blocare și aplicați peste noapte la 4 ° C. Apoi, țesutul a fost spălat de două ori cu PBS/0,1% Triton X-100 și incubat încă 60 de minute cu o diluție de 1: 500 a anticorpilor secundari marcați cu fluorescență (capră anti-șoarece Alexa546; capră anti-iepure Alexa488, Invitrogen) tampon. Secțiunile au fost spălate de două ori cu PBS/0,1% Triton X-100, contracolorate cu 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) și montate în mediu de montare fluorescentă (DAKO). Toate imaginile secțiunilor de țesut au fost colectate pe un microscop Olympus IX50 în combinație cu sistemul de imagine moale Color View.

Cultură de celule.

Culturile precursoare ale neuronilor granulelor cerebeloase au fost generate așa cum s-a descris anterior (Lorenz și colab., 2011). Pe scurt, cerebela puilor din ziua 5 postnatală (P5) au fost scoși și preparați în HBSS (Invitrogen) cu glucoză adăugată. Meningele și țesutul plexului au fost îndepărtate cu atenție. Disocierea cerebelului colectat a fost declanșată de tripsină-EDTA-DNază. HBSS a fost înlocuit cu mediu de cultură care conține DMEM-F12 (Invitrogen), 25 m m KCl, supliment N2 (Invitrogen), penicilină-streptomicină (Pen-strep) și 10% ser fetal de vițel (FCS) (Sigma). După centrifugare, celulele au fost placate la o concentrație de 3 milioane/ml în godeuri pre-acoperite cu poli-l-ornitină (Sigma) și incubate la 37 ° C timp de 6-12 ore pentru recuperare. Apoi, mediul a fost schimbat în mediu de cultură fără ser care conține proteine ​​Shh (sisteme R&D) la o concentrație de 3 μg/ml.

Producerea virusului IRES-GFP și Cre-IRES-GFP a fost realizată așa cum a fost publicat anterior (Lorenz și colab., 2011). Pe scurt, 293 celule de ambalare (Invitrogen) au fost crescute în DMEM-10% FCS-Pen-strep-300 μg/ml G418 și transfectate cu 10 μg din fiecare construcție de virus, precum și plasmide vsv-g și gag-pol, utilizând Reactiv de transfecție Fugene 6 (Roche). Mediul care conține viruși (fără G418) a fost colectat la fiecare 24 de ore timp de 3 zile consecutive, combinat, filtrat și depozitat la -80 ° C până la utilizare.

Pentru experimentele prezentate în Figura 2, celulele au fost sortate FACS pe baza expresiei GFP folosind un FACS ARIA III (BD Bioscience). După sortarea FACS, celulele au fost replatate la o densitate de 3 milioane/ml în godeuri pre-acoperite cu poli-l-ornitină (Sigma) și incubate la 37 ° C timp de 6-12 ore pentru recuperare. Aceste celule au fost utilizate în cele din urmă pentru experimentele de numărare a celulelor [folosind camera Neubauer și contorul automat de celule TC10 (Bio-Rad)] și pentru analize de ARN.

Extracția acidului nucleic și analize PCR.
Cuantificări și statistici.

Analiza fenotipurilor de la șoareci knock-out condiționali a fost efectuată pentru cel puțin trei șoareci din fiecare genotip și fiecare vârstă, care au fost luați cu toții de la diferite porturi.

Mutațiile din SMARCA4 sunt, deși rare, detectabile și în AT/RT umane și ne-am pus la îndoială dacă o ștergere a Smarca4 în precursorii celulelor granulei cerebeloase a dus la formarea tumorii. Așa cum se arată în Figura 1, V - EE, acest lucru nu a fost cazul, iar șoarecii Math1-cre: Smarca4 fl/fl au prezentat un fenotip care a fost foarte similar cu modificările observate la șoarecii Math1-cre: Smarcb1 fl/fl, atât în ​​ceea ce privește trăsăturile histomorfologice, cât și expresia NeuN și Calbindin.

Pierderea Smarcb1 duce la deficite severe de proliferare a precursorilor de neuroni granulari și activarea semnalizării Wnt

Pierderea Smarcb1 afectează proliferarea și activează semnalizarea Wnt în precursorii celulelor granulelor cerebeloase. Precursorii de celule granulare cerebeloase au fost izolați de la șoareci Smarcb1 fl/fl în ziua P5, cultivați și transduși cu viruși IRES-GFP sau Cre-IRES-GFP. La 36 de ore după transducție, celulele au fost sortate pentru celule GFP-pozitive și s-au efectuat experimente. Celulele transduse de Cre-IRES-GFP au prezentat o reducere severă a expresiei Smarcb1, așa cum era de așteptat (A). În plus, proliferarea a fost semnificativ redusă (B) și celulele din starea Cre-IRES-GFP au fost caracterizate printr-o reglare ascendentă masivă a genelor țintă Wnt Tcf4, Lef1, Dkk1 și Axin2. Nu s-au observat modificări semnificative în ceea ce privește expresia Ink4a, Gli1, Gli2, Gli3 sau Cyclin D1 (C).

Nu există tumori cerebrale după pierderea pe scară largă a Smarcb1 la precursorii neuronali hGFAP-pozitivi

Pierderea Smarcb1 în celulele precursoare hGFAP-pozitive are ca rezultat în mod similar cerebela hipoplazică, dar nu și formarea tumorilor cerebrale. Creșterea cerebelară în hGFAP-cre: Smarcb1 fl/fl a scăzut dramatic în comparație cu martorii (pete H&E ale creierelor tăiate sagital; A, B vs. E, F) cu lipsă de foliație și laminare corticală (C, D vs. G, H). Mai mult, am detectat tulburări severe de laminare și o subțiere a cortexului cerebral (A vs. E), indicând faptul că Smarcb1 este la fel de important pentru dezvoltarea creierului anterior. Barele la scară: A, E, 2 mm; B, 500 μm; F, 300 μm; C, D, G, H, 100 μm.

Discuţie

Arătăm aici că pierderea Smarcb1 și Smarca4 duce la deficite severe de proliferare a precursorilor de neuroni granulari și la un cerebel hipoplastic. Prin urmare, Smarcb1 și Smarca4 au roluri proliferative în precursorii neuronilor granulelor cerebeloase. Funcții pro-proliferative similare ale SMARCA4 au fost detectate în celulele stem embrionare (Ho și colab., 2011). Într-un alt studiu, șoarecii inv/inv Smarcb1 au murit din cauza insuficienței severe a măduvei osoase, care ar putea fi legată de un eșec al proliferării celulelor stem hematopoietice (Roberts și colab., 2002). Împreună, aceste rezultate arată că SMARCB1 și SMARCA4 au în mod clar funcții diverse care pot fi de tip celular și/sau specifice punctului de timp.

În afară de implicarea Sonic Hedgehog (Jagani și colab., 2010) și de semnalizare Hippo (Jeibmann și colab., 2014), s-a demonstrat că tumorile rabdoide prezintă semnalizare Wnt modificată (Mora-Blanco și colab., 2014). Rezultatele noastre de la precursorii celulelor granulare sugerează că Smarcb1 duce la o dereglare a semnalizării Wnt/β-catenină, care apare independent de context. În contrast, o pierdere de Smarca4, care a avut efecte comparabile cu cele cauzate de o pierdere de Smarcb1, sa dovedit anterior că inhibă efectele mitogene ale semnalizării ariciului sonic în precursorii normali ai celulelor granulelor cerebeloase (Zhan și colab., 2011). În același timp, semnalizarea Wnt a fost descrisă pentru a afecta proliferarea precursorilor de neuroni granulari și pentru a contracara formarea meduloblastomului asociat cu Shh (Pöschl și colab., 2014b). Prin urmare, datele noastre sunt compatibile cu un scenariu în care pierderea proteinelor Smarc inhibă proliferarea condusă de Shh a precursorilor celulelor granulei cerebeloase prin reglarea în sus a semnalizării Wnt.

Note de subsol

Această lucrare a fost susținută de German Cancer Aid (Max-Eder-Programm), Else-Kröner-Fresenius-Stiftung și Wilhelm Sander Stiftung (toate în SUA); și FMI Münster, IZKF Münster și Fundația Sonja Wasowicz (toate către K.K.). Suntem datori lui M. Schmidt pentru asistență tehnică de specialitate. Mulțumim lui Charles Roberts (Dana Faber Cancer Institute, Boston) pentru furnizarea de șoareci Smarcb1 fl/fl și Pierre Chambon (IGBMC, Illkirch-Graffenstaden, Franța) pentru furnizarea de șoareci Smarca4 fl/fl.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.