Biologie a bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

greutate

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologie a bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologie a bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Biologia bolilor metabolice, Bristol - Myers Squibb Co. Cercetare și dezvoltare, Hopewell, New Jersey, SUA

Abstract

Introducere

Obezitatea este rezultatul unui dezechilibru pozitiv între consumul de energie și consumul de energie, unde magnitudinea dezechilibrului poate fi mai mică de 100 kcal/zi ((1)). Prin urmare, un echilibru negativ indus de aceeași magnitudine ar fi necesar pentru a preveni obezitatea și un dezechilibru negativ mai mare ar fi necesar pentru ao inversa ((2)). Prima lege a termodinamicii sugerează că există doar două modalități de a induce un echilibru energetic negativ: reducerea aportului de energie sau creșterea cheltuielilor de energie. Deși exercițiile fizice pot crește cheltuielile de energie, datele despre exerciții ca metodă de producere a pierderii semnificative în greutate sunt echivoce, cu mai multe rapoarte care arată o eficacitate minimă sau nulă la femei și eficacitate modestă la bărbați Spre deosebire de partea ecuației de cheltuieli energetice, aportul de energie este relativ voluntar și, prin urmare, este susceptibil de manipulare. Nu este surprinzător faptul că restricția de dietă oferă o eficacitate excelentă pe termen scurt. Din păcate, nu s-a dovedit a fi eficient pe termen lung, probabil din cauza răspunsurilor compensatorii comportamentale și metabolice (1), (4)).

O metodă alternativă de reducere a aportului de energie este reducerea absorbției calorice. Acest lucru poate fi realizat prin reducerea absorbției nutrienților în intestin, dar are efecte secundare, cum ar fi diareea sau cel puțin probleme de tolerabilitate, cum ar fi scurgerea fecală observată cu inhibitorii lipazei pancreatice. Rinichiul este, de asemenea, un loc pentru „absorbție” calorică semnificativă, reabsorbind (la om) ∼180 g/zi de glucoză prin intermediul proteinelor transportoare localizate în tubii proximali ((5), (6)). Deși există mai multe proteine ​​care mediază transportul glucozei în tubul proximal, proteina responsabilă pentru majoritatea reabsorbției glucozei în rinichi este cotransportorul glucozei de sodiu - 2 (SGLT2) (5), (7)). Este exprimat pe suprafața luminală a celulelor din segmentul S1 al tubului proximal și este localizat în mod specific la rinichi ((8)). În plus, există și alte SGLT exprimate în rinichi, care cotransportă monosacaride împreună cu sodiu (SGLT1, cotransportor sodiu/mioinozitol (SMIT), SGLT4, SGLT5 și potențial SGLT6) (6), (7), (8), (9) ), (10), (11), (12), (13), (14), (15)). SGLT2 este un cotransportor cu afinitate scăzută, cu capacitate mare, cu un raport de cotransport 1: 1 sodiu la moleculă de glucoză (5), (6)).

Metode și proceduri

Subiecte

Șobolanii masculi Sprague - Dawley (Charles River Laboratories, Bar Harbor, ME; 250-300 g) au fost adăpostiți individual în cuști din polipropilenă și au fost menținuți într-un ciclu de lumină/întuneric 12:12, cu luminile stinse la ora 16:00. Camera pentru animale a fost menținută la 72 ° F (22 ° C) și 50% umiditate. Toate animalele au primit hrană și apă ad libitum, dacă nu se specifică altfel. Șobolanilor li s-a făcut obez oferindu-le alegerea a două opțiuni de dietă diferite; Harlan Teklad Rodent Diet (18% proteine, 73% carbohidrați și 5% grăsimi; 3,4 kcal/g) și Research Diet D12327 (20% proteine, 40% carbohidrați ca zaharoză și 40% grăsimi ca soia și ulei de cocos; 4,59 kcal/d). Șobolanii au fost menținuți pe această dietă de alegere pentru o perioadă de 10 săptămâni înainte de tratamentul medicamentos, moment în care greutatea corporală medie a fost de 654 ± 4,4 g. Toate animalele au fost întreținute la facilitățile Bristol - Myers Squibb în conformitate cu liniile directoare stabilite de Asociația pentru evaluarea și acreditarea îngrijirii animalelor de laborator (AAALAC) și toate protocoalele au fost aprobate de Comitetul Bristol - Myers Squibb pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (ACUC).

Droguri

Dapagliflozin a fost administrat prin gavaj oral într-un vehicul format din: 5% m - pirol, 20% polietilen glicol, 20 mmol/l difosfat de sodiu și apă într-un volum de 3 ml/kg. Dapagliflozin a fost sintetizat de Departamentul de Chimie de la Bristol - Myers Squibb la o puritate estimată la> 96%. Dapagliflozin este un puternic inhibitor SGLT2, cu o concentrație inhibitoare jumătate maximă (IC50) de 1,12 ± 0,065 nmol/l și 3,0 ± 0,5 nmol/l pentru transportorii recombinați umani și respectiv pentru șobolanii recombinați SGLT2 (20). De asemenea, este selectiv împotriva transportorului SGLT1, cu 1.200 × selectivitate împotriva transportatorului SGLT1 uman și 200 × selectivitate împotriva proteinei transportoare SGLT1 a șobolanului (20).

Proiecta

Șobolanii au fost repartizați la unul dintre cele cinci grupuri de tratament pe baza greutății corporale și a aportului total de alimente care au fost măsurate cu 2 săptămâni înainte de tratamentul medicamentos. Grupurile de tratament au fost: vehicul, dapagliflozin (Dapa) la 0,5 mg/kg (0,5 mpk), 1 mg/kg (1 mpk) și 5 mg/kg (5 mpk) și încă 5 mg/kg (5 mpk) grup în care fiecare animal a fost limitat la aportul de hrană al unui vehicul „asociat” atribuit - omolog tratat măsurat cu 24 de ore mai devreme (5 mpk PF - V). Șobolanii din grupul PF - V de 5 mpk au fost asortate individual cu animalele tratate cu vehicul, pe baza greutății corporale inițiale și a aportului de alimente. În fiecare grup erau 6-8 animale. Măsurătorile inițiale ale volumului de urină și ale concentrației de glucoză, precum și chimia clinică în repaus au fost efectuate cu 1-2 săptămâni înainte de debutul tratamentului medicamentos (cronologia pentru toate studiile prezentate mai jos poate fi găsită în figura 1).

Cronologia evaluărilor metabolice efectuate în timpul studiului de 38 de zile. RMN, imagistica prin rezonanță magnetică.

Metode generale

Aportul alimentar, preferințele alimentare, greutatea corporală și consumul de apă. Toate animalele au fost tratate cu dapagliflozin sau vehicul cu 1 oră înainte de debutul ciclului de întuneric în fiecare zi pentru o perioadă de 38 de zile. Greutatea corporală, aportul alimentar ambelor opțiuni dietetice și aportul de apă au fost măsurate în timpul tratamentului medicamentos în fiecare zi pentru o perioadă de 34 de zile. Datorită perioadelor multiple de colectare a sângelui și de post care au avut loc după ziua 34, greutatea corporală și aportul de alimente nu au fost analizate după acest moment. Greutatea corporală a fost exprimată ca o schimbare procentuală față de greutatea corporală inițială, unde valoarea inițială a fost definită ca greutatea medie corporală cu 1 zi înainte de debutul tratamentului medicamentos. Aportul de alimente a fost exprimat ca suma celor două opțiuni de dietă consumate în fiecare zi în kilocalorii. Valoarea energetică a alimentelor consumate în fiecare zi a fost calculată ca cantitate de alimente consumate în grame înmulțită cu valoarea calorică a fiecărei diete (3,4 kcal/g pentru chow-ul standard Harlan Teklad și 4,59 kcal/g pentru opțiunea de dietă bogată în energie) . Consumul de apă a fost exprimat ca volum consumat în fiecare zi, derivat din greutatea zilnică a sticlei de apă, presupunând 1 ml/g de greutate.

Calorimetre indirecte

Compozitia corpului

Compoziția corpului a fost evaluată în ziua 23 a studiului utilizând un RMN Echo de la Echo Medical Systems (Modelul șobolanului 900, 2004; Houston, TX). Grăsimea corporală și masa slabă au fost evaluate direct din software-ul Echo MRI și normalizate la greutatea corporală.

Volumul de urină și concentrația de glucoză

Un subset de animale (vehicul, 5 mpk și 5 mpk PF-V) au fost plasate în cuști metabolice individuale în ziua 21 pentru colectarea probelor de urină de 24 de ore și au avut ad libitum acces la apă și alimente, cu excepția cazului în care acestea au fost alocate grupului Dapa 5 mpk PF - V. Probele de urină au fost înghețate la -20 ° C până când măsurarea volumului și determinarea concentrațiilor de glucoză au fost efectuate folosind un Olympus AU680 (Beckman Coulter, Brea, CA).

Chimie clinică nedorită

Sângele a fost colectat în zilele 7, 17 și 35 în tuburi tratate cu acid etilendiaminetetraacetic. Probele au fost centrifugate timp de 15 minute la 10.000g într-o centrifugă refrigerată (4 ° C). Plasma a fost depozitată la -20 ° C până la analiză. Plasma a fost analizată pentru azot uree din sânge (BUN), glucoză (GLU), acizi grași liberi neesterificați (NEFA) și 3-hidroxibutirat (BHBA) folosind Beckman Coulter Olympus AU680. Toate kiturile de testare au fost furnizate de Microgenics MAS (Freemont, CA), cu excepția NEFA (Wako, Richmond, VA). Plasma a fost analizată de ELISA pentru insulină (Mercodia AB, Uppsala, Suedia).

Chimie clinică de post

După un repaus peste noapte (16 ore) cu 9 zile înainte de debutul tratamentului și în ziua 38 de tratament, sângele a fost colectat de la toate animalele și analizat pentru aceleași variabile folosind metodele descrise mai sus. În plus, nivelurile plasmatice de leptină au fost măsurate utilizând ELISA (Millipore, Billerica, MA).

analize statistice

Datele colectate de-a lungul timpului, cum ar fi greutatea corporală, aportul alimentar, preferințele alimentare, consumul de apă și calorimetria indirectă de 20 de ore au fost analizate prin măsurători repetate ale ANOVA. Acolo unde s-au produs efecte semnificative ale tratamentului sau interacțiuni între tratament și timp, s-a efectuat o analiză simplă a efectelor, urmată de comparații de grup post-hoc folosind diferența cea mai mică protejată (PLSD) a lui Fisher. În cazurile în care au existat efecte principale semnificative ale timpului, scorurile diferențelor au fost calculate prin scăderea datelor din ziua 7 (chimie clinică fără post) sau din datele de bază (chimie clinică în post). Aceste scoruri au fost apoi analizate utilizând ANOVA unidirecțional cu PLSD Fisher ca test post-hoc pentru comparații de grup. Consumul de oxigen și RER au fost analizate pe 32 de intervale, scăzând primele 2 intervale din cauza variabilității în timp necesare pentru ca fiecare animal să se obișnuiască cu camera de testare. Datele au fost apoi analizate ca medii pe ciclurile de întuneric și lumină de 12 ore. Aceste perioade au fost apoi analizate prin ANOVA unidirecțional, urmate de comparații post-hoc de grup cu testul PLSD al lui Fisher, la fel ca datele cu un singur punct de timp.

Rezultate

Greutate corporala

Măsurile repetate ale ANOVA asupra greutății corporale absolute au evidențiat un efect semnificativ al tratamentului (F (4, 1.056) = 3,8; P Tabelul 1. Rezumatul bilanțului energetic

Efectul dapagliflozinului asupra greutății corporale și a compoziției corpului la șobolanii DIO. (A) Modificarea procentuală față de greutatea corporală inițială în timpul tratamentului cu dapagliflozin. Ziua 34 la sută schimbare față de greutatea corporală de bază scăzută din vehicul este prezentată în textul adiacent grupului corespunzător din grafic. Greutatea corporală de bază a fost următoarea (g): Vehicul (649 ± 10,8), Dapa 0,5 mpk (663,5 ± 11,3), Dapa 1 mpk (660,6 ± 9,9), Dapa 5 mpk (651,34 ± 8,7) și Dapa 5 mpk PF‐ V (647 ± 11,8). *P

Compozitia corpului

Când grăsimea corporală a fost normalizată la greutatea corporală și exprimată în procente de grăsime, ANOVA a dezvăluit un efect semnificativ de tratament (F (4, 33) = 3,3; P

Aportul alimentar

Măsurile repetate ale ANOVA au relevat un tratament semnificativ (F (4, 900) = 13,5; P

Efectul dapagliflozinului asupra consumului de alimente și apă la șobolanii DIO. (A) Aportul zilnic mediu de alimente (total kcal ± SEM) în timpul tratamentului cu dapagliflozin. * (Dapa 5 mpk) P

Consum de apă

Măsurile repetate ale ANOVA au relevat un tratament semnificativ (F (4, 651) = 34,6; P

Cheltuieli și utilizare a energiei

ANOVA pentru consumul de oxigen normalizat până la masa slabă (masă fără grăsimi) în medie pe ciclul întunecat sau pe ciclul luminii nu a evidențiat efecte semnificative ale tratamentului (F (4, 24) = 1,1; P

Efectul dapagliflozinului asupra vO2, a căldurii și a raportului de schimb respirator (RER). (A) Consumul de oxigen s-a normalizat la masa slabă (fără grăsimi) (FFM) în ziua 15 a tratamentului, calculat în medie pe ciclul de întuneric sau pe cel de lumină. (b) Producția de căldură în ziua 15 a tratamentului, calculată în medie pe ciclul întunecat sau cel luminos și normalizată la FFM slabă. (c) RER în ziua 15 a tratamentului, calculat în medie pe ciclul de întuneric sau pe cel de lumină. Animalele au avut acces la alimente în timpul măsurătorilor indirecte de calorimetrie și nu au prezentat modificări semnificative ale aportului de alimente sau ale greutății corporale față de ziua 14 în această perioadă de măsurare. N = 5-6/grup. *P

Efectele cronice ale dapagliflozinei (5 mpk) asupra volumului de urină și excreției de glucoză la șobolanii DIO

(masa 2) ANOVA a relevat efecte semnificative ale tratamentului asupra volumului de urină (F (2, 18) = 105,4; P Tabelul 2. Volumul de urină și concentrația de glucoză

Chimia clinică în stare fără post

(Tabelul 3) Analiza măsurilor repetate a insulinei, glucozei, NEFA, BHBA și BUN a evidențiat efecte semnificative ale tratamentului, timpului și/sau tratamentului × timp pentru interacțiunea insulinei (F (4, 60) = 3,3; P Tabelul 3. Chimie clinică fără post

Chimia clinică la animalele de post

(Tabelul 4) Au existat efecte semnificative de tratament pentru glucoză (F (4, 32) = 39,3; P Tabelul 4. Chimie clinică postită

Discuţie

Pierderea în greutate pare să fie o funcție a masei adipoase reduse față de greutatea corporală totală, deși este surprinzător faptul că nu a existat o diferență în procente de grăsime între ad libitum‐Fed 5 mpk group și omologii lor de 5 mpk PF - V (similar cu datele de leptină de post). Baza pentru această constatare nu este clară în acest moment.

Datele noastre sugerează că creșterea consumului de alimente observată la animalele tratate cu dapagliflozin a fost un răspuns adaptativ sau compensatoriu la excreția involuntară de glucoză, mai degrabă decât un efect direct al inhibiției SGLT2 asupra consumului de alimente. De exemplu, a fost necesară cel puțin o săptămână de administrare a medicamentului pentru a observa hiperfagia semnificativă. În schimb, o creștere a consumului de apă și o reducere a greutății corporale au fost evidente după o singură administrare de dapagliflozin (0,5 mpk, 5 mpk și 5 mpk PF-V), toate acestea putând reflecta efectele acute ale inhibiției SGLT2 asupra urinei volumul și excreția de glucoză ((17), (20), (27), (28)). În plus, prevenirea hiperfagiei prin restrângerea animalelor tratate cu dapagliflozin la aportul alimentar al omologilor tratați cu vehicul a dus la o scădere semnificativ mai mare în greutate decât a fost observată în ad libitum- Omologii alimentați. În cele din urmă, dovezile pentru exprimarea SGLT2 în creier sunt controversate în cel mai bun caz. Un raport de expresie de nivel scăzut, cu toate că ((29)), SGLT2 nu pare a fi exprimat în creier ((8)). Există un număr tot mai mare de literatură care subliniază importanța detectării nutrienților în controlul consumului de alimente ((30)), care este un mecanism rezonabil pentru hiperfagia compensatorie observată în acest studiu.

În general, a apărut că hiperfagia a fost o adaptare fiziologic „suficientă” la consecințele metabolice ale excursiei cronice de glucoză urinară, deoarece modificările dependente de doză ale surselor de energie, cum ar fi cetonele sau glucoza, au fost evidente doar în starea de repaus alimentar. Interesant este faptul că grupul de 5 mpk PF - V a demonstrat reducerea RER și cetone crescute chiar și în starea de hrănire, sugerând că, dacă hiperfagiei nu i se permite să compenseze pierderea de calorii excretate în urină, au fost utilizate alte surse de energie pentru a menține echilibrul energetic.

Cu toate acestea, doi parametri au fost modificați în funcție de doză de dapagliflozin chiar și în starea alimentată: nivelurile de BUN și insulină. Probabil că modificările nivelurilor BUN reflectă efectele diuretice ale dapgliflozinului. Gradul de creștere a nivelului BUN ar putea sugera o diminuare ușoară (nu semnificativă din punct de vedere clinic) a volumului, efect care a fost observat și la oameni (19), (23)). Așa cum era de așteptat, pe lângă compensarea echilibrului energetic negativ indus de dapagliflozin, animalele par să compenseze și efectele diuretice ale inhibiției SGLT2 prin creșterea consumului de apă. Într-adevăr, inspecția datelor privind consumul de apă în timpul perioadei de 24 de ore de măsurare a glucozei în urină a sugerat că animalele DIO au compensat creșterea volumului de urină indusă de dapagliflozin pe o bază de aproape 1: 1 (volumul de urină: aportul de apă) (tabelul 1).

Celălalt parametru care a fost modificat semnificativ în starea alimentată a fost insulina. Nivelurile de insulină au fost reduse în raport cu vehiculul până în ziua 35 chiar la cea mai mică doză (0,5 mg/kg) în toate grupurile, inclusiv în grupul de 5 mpk PF - V. Deși acesta ar putea fi un răspuns așteptat la reducerea glucozei circulante, niciunul dintre aceste grupuri nu a prezentat reduceri semnificative ale glucozei plasmatice față de vehicul. Există date care sugerează că tratamentul cu dapagliflozin poate îmbunătăți sensibilitatea la insulină, după cum a fost evaluat prin clema hiperglicemică (31). Desigur, dacă reducerea insulinei hrănite împreună cu pierderea în greutate observată în studiul actual ar putea sugera, de asemenea, o îmbunătățire a sensibilității la insulină, este, desigur, neclar fără date suplimentare care să abordeze în mod specific această întrebare.

Pe scurt, dapagliflozin a indus un bilanț energetic negativ net la șobolanii DIO, care a fost parțial compensat de hiperfagia compensatorie. Când s-a prevenit hiperfagia compensatorie, magnitudinea pierderii în greutate a fost semnificativ crescută. Acest lucru ar putea sugera că o combinație a unui inhibitor SGLT2 cu un inhibitor al apetitului sau restricție calorică ar putea produce o scădere în greutate sporită, cu avertizarea că hiperfagia compensatorie nu poate juca un rol la fel de mare la om ca și la mamiferele mai mici, cum ar fi rozătoarele.

Confirmare

Autorii sunt recunoscători lui Jean Whaley, James List și Elizabeth Svanberg de la Bristol - Myers Squibb Co. pentru comentariile lor perspicace cu privire la manuscris. Acest studiu a fost realizat în colaborare cu Astra - Zeneca.

Dezvăluire

Toți autorii sunt angajați ai Bristol - Myers Squibb.