Laboratorul de Neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Corespondenţă

Marina Y. Khodanovich, Laboratorul de Neurobiologie, Universitatea de Stat Tomsk, 36 Lenina Ave., Tomsk 634050, Federația Rusă.

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Prenolica Limited (fostă Solagran Limited), Biotechnology Company, Melbourne, Victoria, Australia

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Departamentul de Radiologie, Universitatea din Washington, Seattle, WA, SUA

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Corespondenţă

Marina Y. Khodanovich, Laboratorul de Neurobiologie, Universitatea de Stat Tomsk, 36 Lenina Ave., Tomsk 634050, Federația Rusă.

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Prenolica Limited (fostă Solagran Limited), Biotechnology Company, Melbourne, Victoria, Australia

Laboratorul de neurobiologie, Universitatea de Stat din Tomsk, Tomsk, Federația Rusă

Departamentul de Radiologie, Universitatea din Washington, Seattle, WA, SUA

Abstract

1. INTRODUCERE

Polipenolii sunt alcooli izoprenoizi cu lanț lung bioactivi care apar în diferite plante. Spre deosebire de cele mai populare din zona polifenolilor nutriționali, care conțin mai multe unități structurale fenolice, poliprenolii constau din părți hidrofile și hidrofobe: o grupare hidroxil și un lanț izoprenil lung nesaturat, în principal cu configurație poli-cis. În funcție de sursă, lungimea lanțului de poliprenoli naturali variază de la 6 la 40 de unități de izopren (Roslinska, Walinska, Swiezewska și Chojnacki, 2002; Zhang și colab., 2015).

Poliprenolii și metaboliții lor au atras o atenție considerabilă datorită activității lor hepatoprotectoare, antioxidante, neuroprotectoare, imunomodulatoare și proliferative. Yang, Wang, Ye și Li (2011) și J. Yu și colab. (2012) au demonstrat efectul hepatoprotector al poliprenolilor în modelul afectării hepatice induse de tetraclorură utilizând teste funcționale hepatice și histologie. Autorii au asociat efectul cu o reducere a leziunilor oxidative, reglarea descendentă a stimulilor pro-fibrogenici, inhibarea activării celulelor stelate hepatice și protecția hepatocitelor. Într-un studiu clinic pilot, tratamentul cu polipenol de 30 de zile la pacienții cu alcoolism cronic (Soultanov și colab., 2010) a dus la îmbunătățirea semnificativă a biochimiei sângelui în funcție de testele clinice hepatice, pancreasice și renale.

Proprietățile imunomodulatoare și antivirale ușoare ale polifenil fosfaților au fost arătate de Pronin și colab. (2002). Autorii au raportat inhibarea unei faze incipiente a interacțiunii interleukinei 1 și Con A în celulele splinei, activitatea lipoxigenazei și expresia receptorilor interleukinei 2 de către polipenilfosfați. În același timp, fosprenilul a stimulat activitatea naturală a celulelor ucigașe și producția timpurie de TNF-α (Pronin și colab., 2002).

Datorită participării la biosinteza glicanului și a glicozilării proteinelor N-legate, polifenil fosfații și dolichil fosfatul sunt regulatori importanți ai proliferării celulare. S-a demonstrat că rata sintezei de dolichil fosfat și glicoproteine ​​este legată de rata de creștere a celulelor ovariene de hamster chinezesc și a diviziunii celulare (Hartley și Imperiali, 2012; Swiezewska și Danikiewicz, 2005). Mai mult, studiile au confirmat că fosfatul de dolichil este un substrat care limitează rata în glicozilarea legată de N și, prin urmare, este un factor cheie în dezvoltarea celulară (Hartley și Imperiali, 2012; Swiezewska și Danikiewicz, 2005). Inhibarea biosintezei poliizoprenolului a dus la gastrulare anormală, corelată cu incapacitatea celulei de a produce glicoproteine. Adăugarea de dolichol exogen a permis o gastrulare normală, sugerând că fosfatul de dolichil este un reactiv limitativ pentru glicozilarea N a proteinelor și transformările celulare ulterioare (Hartley & Imperiali, 2012).

Ipotezăm că spectrul activității biologice a poliprenolilor poate avea un interes semnificativ în tratamentul sclerozei multiple (SM), o tulburare cronică inflamatorie demielinizantă și neurodegenerativă. În plus față de terapiile tradiționale anti-inflamatorii ale MS, utilizarea medicinei pe bază de plante complementare și alternative a câștigat o atenție substanțială în ultimii ani ca modalitate de a atenua deficitul neurologic și de a spori neuroprotecția (Mojaverrostami, Bojnordi, Ghasemi - Kasman, Ebrahimzadeh și Hamidabadi, 2018; Zarshenas, Ansari, Dadbakhsh și Mohammadi, 2018). Căutarea de noi agenți care ar putea permite refacerea mielinei deteriorate și prevenirea neurodegenerării este de o importanță crucială pentru progresele ulterioare în tratamentul acestei afecțiuni. Având în vedere efectul poliprenolilor în diferite condiții neurologice și cognitive demonstrate la modelele animale și la oameni și faptul că toxicitatea poliprenolilor puri este practic absentă (Wang, Yuan, Li, Zhang și Ye, 2015), aceste substanțe pot fi de interes pentru testarea preclinică la modelele animale de SM.

2. MATERIALE ȘI METODE

2.1 Animale

2.2 Substanțe

Demielinizarea a fost indusă la șoareci cu cuprizonă (bis (ciclohexanonă) oxaldihidrazonă, Sigma-Aldrich, SUA). Polipenoli de calitate farmaceutică (cel puțin 95% polipenoli sau alcooli izoprenoidi cu lanț lung, inclusiv opt până la 18 reziduuri de izopren) au fost izolați din verdeața verde a Picea abies (L.) Carst așa cum a fost descris anterior (Fedotova și colab., 2012) și furnizat ca formă farmaceutică înregistrată (Ropren®, Prenolica Limited, Melbourne, Australia). Vehiculul petrolier utilizat în acest studiu a fost ulei de măsline rafinat 100% (F.lli Ruata S.p.A., Italia).

2.3 Proiectare experimentală

2.4 Testarea în câmp deschis

Cu două zile înainte de eutanasie, toți șoarecii au fost testați într-un câmp deschis, constând dintr-o cameră de 50 × 50 - cm 2 căptușită cu 25 (5 × 5) pătrate înconjurate de pereți înalți de 40 cm. Următorii parametri ai comportamentului animalului au fost numărați pe parcursul a 5 minute de testare: (a) activitate locomotorie ca număr de pătrate încrucișate, (b) activitate verticală ca număr de creșteri, (c) activitate de îngrijire ca număr de acte de îngrijire complete și (d) numărul total de defecții și micțiuni, care a fost considerat un indicator al comportamentului asemănător anxietății.

2.5 Imunofluorescența

Diapozitivele au fost acoperite cu mediu de montare cu DAPI (4 ′, 6 - diamidino - 2 - fenilindol, culoare albastră, contracolor nuclear). De la fiecare animal, s-au obținut secțiuni atât ale emisferelor stângi cât și ale celei drepte. Fotografia a fost realizată folosind un microscop Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Germania) și software-ul AxioVision 4.8 (Carl Zeiss) cu un modul MozaiX, care permite crearea de imagini ale întregului creier prin îmbinarea unor imagini mai mici. Au fost stabiliți parametri identici de imagine pentru toate secțiunile fotografiate. În plus, secțiunile colorate cu NG2 au fost fotografiate folosind un microscop confocal cu laser LSM 780 OZN (Carl Zeiss).

2.6 Prelucrarea imaginilor

Analiza imaginii a fost efectuată utilizând software-ul ImageJ. Regiunile de interes (ROI) de dimensiune standard au fost plasate manual pe imaginile MBP în părțile centrale și distale ale corpului calos (100 × 200 μm 2), cortexul motor (200 × 200 μm 2), centrul putamenului caudat (200 × 200 μm 2), iar hipocampul (200 × 200 μm 2). Densitatea mielinei pe imaginile MBP a fost cuantificată în structurile de mai sus prin măsurarea intensității medii în ROI-urile corespunzătoare. Intensitățile medii de la fiecare structură au fost calculate în medie pe ROI și pe fotografii pentru fiecare animal. În plus, MBP a fost cuantificat din secțiuni colorate utilizând aceleași ROI și metoda de prag Otsu în implementarea ImageJ. Procentul din suprafața totală a obiectelor detectate a fost utilizat ca măsură surogat a densității MBP (Ercan și colab., 2017).

Oligodendrogeneza a fost evaluată într-o serie de structuri de substanță albă și cenușie, inclusiv corpul calos, cortex și putamen caudat. ROI de dimensiune standard (100 × 200 μm 2 pentru corpul calos, 200 × 200 μm 2 pentru cortex și putamen caudat) au fost plasate manual pe imagini colorate NG2 în hărțile de structură a creierului investigate folosind un atlas cerebral de șoarece. Numărul de celule NG2-pozitive a fost numărat în interiorul fiecărui ROI și calculat ca un număr corespunzător de celule NG2-pozitive împărțit la aria ROI. Numărul de celule DCX-pozitive a fost numărat vizual în zone bine cunoscute de neurogeneză activă a creierului adult - zona subgranulară a girusului dentat și zona subventriculară (SVZ). Au fost analizate cinci secțiuni ale creierului pentru fiecare animal și fiecare anticorp. Procedurile imuhistologice și analiza imaginii au fost efectuate de cercetătorii orbiți de grupul de animale.

2.7 Analiza statistică

Toate analizele statistice au fost efectuate în Statistics 10.0 pentru Windows (StatSoft Inc., Tulsa, OK, SUA). Valorile medii și erorile standard ale tuturor parametrilor investigați au fost calculate pentru fiecare structură anatomică. Normalitatea datelor în cadrul grupurilor de animale a fost evaluată folosind testul Shapiro-Wilk. Testul lui Levene a fost utilizat pentru a evalua omogenitatea variațiilor dintre grupuri. Nu s-au găsit abateri semnificative de la distribuția normală și nu s-au găsit diferențe în variațiile eșantionului și, prin urmare, s-au folosit analize parametrice. Datele comportamentale au fost comparate între grupuri utilizând un model de analiză a varianței cu o singură cale repetată (ANOVA). Datele de imunofluorescență au fost comparate între grupurile martor + vehicul, cuprizon + vehicul și cuprizon + polipenoli utilizând un model ANOVA cu două căi repetate - doi factori: factor „grup” cu trei niveluri, repetat - măsoară factorul „structură” cu un numărul de niveluri în funcție de tipul de etichetare). Au fost efectuate teste post hoc în perechi cu corecția lui Tukey pentru comparații multiple pentru fiecare tip de ANOVA. Semnificația statistică a fost definită ca a p valoare mai mică de 0,05.

3. REZULTATE

3.1 Polipenolii scad deficitul de comportament indus de cuprizonă

Rezultatele testelor în câmp deschis sunt prezentate în Figura 1. Animalele din grupul vehicul cuprizone + au avut o activitate locomotorie și de îngrijire semnificativ mai scăzută și un nivel mai ridicat de comportament asemănător anxietății comparativ cu martorii. Tratamentul cu poliprenol a crescut semnificativ activitatea locomotorie și a inversat complet anxietatea - cum ar fi comportamentul cauzat de alimentarea cu cuprizonă.

recuperează

3.2 Polipenolii scad demielinizarea indusă de cuprizonă

Secțiunile reprezentative ale creierului colorate pentru MBP din grupurile martor + vehicul, cuprizon + vehicul și cuprizon + polipenoli de șoareci sunt prezentate în Figura 2a. Microfotografiile secțiunilor de la șoareci din grupul cuprizonă + vehicul au avut o intensitate mai mică a semnalului fluorescent și un contrast țesut în corpul calos, cortex, hipocamp și putamen caudat comparativ cu grupurile martor + vehicul și cuprizon + polipenoli (Figura 2a). Compararea cantitativă a intensităților medii ale semnalului MBP și a procentului total de MBP - zona pozitivă din corpul calos, cortex, hipocamp și putamen caudat între grupuri este prezentată în Figura 2b. Conținutul de mielină din corpul calos al șoarecilor din grupul cuprizonă + vehicul a scăzut semnificativ în comparație cu grupul martor + vehicul. În contrast, secțiunile de la șoareci tratați cu cuprizonă și polipenoli nu au prezentat o reducere semnificativă a conținutului de MBP în structurile investigate, dar au demonstrat o creștere semnificativă a MBP în comparație cu grupul de vehicule cuprizone +.

3.3 Poliprenolii scad supraproducția oligodendrocitelor

Efectul tratamentului cu cuprizonă și polipenol asupra oligodendrogenezei din creierul șoarecelui a fost examinat folosind colorarea împotriva NG2 (Figura 3). Secțiunile reprezentative ale creierului colorate pentru NG2 din grupurile martor + vehicul, cuprizon + vehicul și cuprizon + polipenoli de șoareci sunt afișate în Figura 3a. În ciuda unei cantități mari de OPC, morfologia oligodendrocitelor imature din grupul cuprizon + vehicul a fost mai puțin dezvoltată decât OPC din grupul martor și grupul cuprizon + polipenoli. Oligodendrocitele imature din fostul grup au avut procese mai scurte, mai simple și mai puțin ramificate. Grupul cuprizonă + vehicul (colorare verde) a arătat o cantitate semnificativ crescută de OPC în corpul calos, cortex și putamen caudat, comparativ cu cuprizona + polipenoli și control + grupurile vehicul (Figura 3b). Numărul de celule NG2 - pozitive din grupul cuprizonă + polipenoli nu a fost semnificativ diferit de grupul martor + vehicul.

3.4 Poliprenolii restabilesc neurogeneza afectată

Efectul tratamentului cu cuprizonă și poliprenol asupra neurogenezei din creierul șoarecelui a fost examinat folosind imunocolorarea împotriva DCX (Figura 4). Secțiunile reprezentative ale creierului colorate pentru DCX (colorare verde) în zonele de neurogeneză activă din grupul martor + vehicul, cuprizon + vehicul și cuprizon + polipenoli de șoareci sunt prezentate în Figura 4a. Tratamentul cu Cuprizone a redus semnificativ numărul de neuroni imaturi pozitivi DCX în ambele zone active ale neurogenezei, SVZ și zona subgranulară (Figura 4b). În grupul cuprizonă + polipenoli, neurogeneza nu a diferit semnificativ de cea din grupul martor.

4. DISCUTIE

Acest studiu arată că leziunile țesuturilor cerebrale ale șoarecilor cauzate de 10 săptămâni de administrare a cuprizonei, inclusiv demielinizarea, supraproducția oligodendrocitelor imature și neurogeneza afectată pot fi reduse substanțial cu tratamentul cu poliprenol în săptămânile 6-10. dintre animalele tratate cu poliprenoli a fost semnificativ mai mare decât cel observat la șoarecii tratați cu cuprizonă cu injecții simulate și nu s-au diferit de grupul de control. Injecțiile cu polipenol au redus, de asemenea, cantitățile de OPC și neuroni imaturi la niveluri normale. Rezultatele studiilor imunohistochimice sunt coroborate de rezultatele testelor în câmp deschis, care au demonstrat că deficitul de comportament cauzat de intoxicația cu cuprizonă a fost mult atenuat sub influența poliprenolilor. În mod specific, tratamentul cu polipenol a inversat complet anxietatea - cum ar fi comportamentul și activitatea locomotorie îmbunătățită, deși nu a afectat activitatea verticală și îngrijirea.

Mecanismul de oprire a efectului neurotoxic al cuprizonei de către poliprenoli poate fi legat de refacerea oligodendrogenezei și neurogenezei afectate și de promovarea remielinizării. Alternativ, poliprenolii pot preveni dezvoltarea stării demielinizării cronice și a neurodegenerării, administrându-se concomitent cu cuprizona. În timp ce elucidarea mecanismului exact de acțiune al poliprenolilor a fost dincolo de scopul acestui studiu pilot, rezultatele noastre demonstrează fără echivoc efectul lor benefic în modelul cuprizone al SM. Sunt necesare mai multe cercetări pentru a identifica dacă aceste beneficii terapeutice sunt fie legate de capacitatea lor de a promova remielinizarea și de a stimula procesele restaurative în SNC, fie de a reflecta efectul lor neuroprotector general.

Observațiile noastre la animalele tratate cu cuprizonă fără administrare de polipenol sunt în conformitate cu literatura de specialitate și confirmă inducerea cu succes a modelului de demielinizare. Conținutul de mielină din corpul calos, cortex, hipocamp și putamen caudat, conform analizei cantitative a imunofluorescenței MBP, a fost redus semnificativ în acest grup, ceea ce este în acord cu studiile anterioare (Gudi și colab., 2014; Khodanovich și colab. ., 2016; Khodanovich și colab., 2017; Kipp și colab., 2009; Koutsoudaki și colab., 2009; Pott și colab., 2009). Deficitul de comportament observat în grupul tratat cu cuprizonă susține prezența demielinizării toxice. Cuprizona a modificat activitatea în câmp deschis către scăderea comportamentului de locomoție și anxietate. Modificări similare în comportamentul șoarecilor tratați cu cuprizonă au fost găsite în studii anterioare (Franco-Pons, Torrente, Colomina și Vilella, 2007). Mai mult, descoperirile recente ale maturizării afectate a oligodendrocitelor (Xing și colab., 2014; Q. Yu și colab., 2017) și neurogeneză (Abe și colab., 2015; Hillis, Davies, Mundim, Al - Dalahmah și Szele, 2016) cauzate de intoxicația cu cuprizonă au fost reproduse în modelul nostru. Se știe că demielinizarea indusă de cuprizonă provoacă supraproducția oligodendrocitelor (Q. Yu și colab., 2017), dar maturarea este întârziată (Xing și colab., 2014). Subpopulația crescută de OPC provine în mare parte din SVZ și migrează în zone demielinizate (Xing și colab., 2014). Am observat o cantitate crescută de OPC, așa cum este indicat de markerul NG2 în structurile cerebrale demielinizate, în acord cu literatura (Xing și colab., 2014; Q. Yu și colab., 2017). Similar studiilor recente (Abe și colab., 2015; Hillis și colab., 2016), am constatat, de asemenea, că cuprizona afectează neurogeneza atât în ​​nișele neurogene, SVZ și stratul subgranular al girusului dentat, așa cum este indicat de numărul redus de DCX - neuroni tineri pozitivi.

5. CONCLUZII

Pe scurt, acest studiu a demonstrat că poliprenolii din plante au potențialul de a repara daunele provocate de cuprizonă la creierul șoarecelui. Rezultatele noastre sugerează că polipenolii pot opri demielinizarea, pot recupera neurogeneza suprimată și pot atenua supraproducția reactivă a oligodendrocitelor imature cauzate de neurotoxicitatea cuprizonei. Având în vedere lipsa unor terapii eficiente de remielinizare pentru SM, polipenolii ar trebui urmăriți rapid pentru teste ulterioare la alte modele animale și la oameni.

MULȚUMIRI

Autorii doresc să-i mulțumească Dr. V. Soultanov pentru contribuția sa intelectuală în analiza rezultatelor studiului. Ropren® pentru testare în modelul cuprizone a fost furnizat de Prenolica Limited (fostă Solagran Limited). Studiul a fost realizat sub sprijinul Ministerului Educației și Științei al Federației Ruse în cadrul proiectului de atribuire a statului nr. 18.2583.2017/4.6. Studiile imunohistochimice au fost efectuate cu sprijinul Fundației pentru Științe din Rusia, proiectul nr. 18‐15‐00229. Asistența editorială a fost asigurată de Dr. Julie Milland. Autorii îi mulțumesc dnei. Svetlana Kildyaeva pentru corectura manuscrisului.

CONFLICTUL DE INTERES

Dr. Trusov este angajat al Prenolica Limited (fostă Solagran Limited), producătorul preparatului de poliprenol (Ropren®) utilizat în acest studiu. Ceilalți autori nu declară niciun conflict de interese.