Roluri Curarea datelor, Scriere - schiță originală

ralstonia

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Roluri Analiza formală

Afiliere Laboratorul Wallenberg, Universitatea din Göteborg, Spitalul Universitar Sahlgrenska, Göteborg, Suedia

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Roluri Metodologie, Scriere - schiță originală, Scriere - recenzie și editare

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Roluri Analiza formală

Afiliere Université catholique de Louvain, WELBIO (Walloon Excellence in Life sciences and BIOtechnology), Institutul de cercetare a drogurilor din Louvain, Bruxelles, Belgia

Roluri Curarea datelor

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Roluri Curarea datelor

Laboratorul de afiliere de microbiologie, Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda

Roluri Analiza formală

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Roluri Curarea datelor

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Roluri Curarea datelor

Afiliații Diabetes Center, Departamentul de Medicină Internă, VU University Medical Center, Amsterdam, Olanda, ICAR, VU University Medical Center, Amsterdam, Olanda

Laboratorul de afiliere de microbiologie, Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda

Roluri Analiză formală, supraveghere

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Laboratorul de afiliere de microbiologie, Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda

Roluri Curarea datelor

Afiliere Laboratorul Wallenberg, Universitatea din Göteborg, Spitalul Universitar Sahlgrenska, Göteborg, Suedia

Departamentul de Chirurgie pentru Afiliere, Spitalul Flevo, Almere, Olanda

Departamentul de Chirurgie pentru Afiliere, Spitalul Sint Lucas Andreas, Amsterdam, Olanda

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Departamentul de afiliere pentru medicină vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda

Departamentul de Medicină Vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda, Departamentul de Pediatrie, Centrul Medical Universitar Groningen, Universitatea din Groningen, Groningen, Olanda

Roluri Conceptualizare, Supraveghere, Scriere - schiță originală, Scriere - recenzie și editare

Afilieri Laboratorul Wallenberg, Universitatea din Göteborg, Spitalul Universitar Sahlgrenska, Göteborg, Suedia, Fundația Novo Nordisk Centrul de Cercetări Metabolice de Bază, Secția pentru Receptologie Metabolică și Enteroendocrinologie, Facultatea de Științe ale Sănătății, Universitatea din Copenhaga, Copenhaga, Danemarca

Roluri Conceptualizare, Resurse, Scriere - schiță originală, Scriere - recenzie și editare

Laboratorul de microbiologie al afilierilor, Universitatea Wageningen, Wageningen, Olanda, RPU Immunobiology, Universitatea din Helsinki, Helsinki, Finlanda

Roluri Conceptualizare, achiziție de fonduri, resurse, supraveghere, scriere - proiect original, scriere - revizuire și editare

Departamentul de Medicină Vasculară, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda, Laboratorul Wallenberg, Universitatea din Gothenburg, Spitalul Universitar Sahlgrenska, Gothenburg, Suedia, Departamentul de Medicină Internă, Centrul Medical Academic, Amsterdam, Olanda, Centrul pentru Diabet, Departamentul de Interne medicină, VU University Medical Center, Amsterdam, Olanda, ICAR, VU University Medical Center, Amsterdam, Olanda

  • Shanthadevi D. Udayappan,
  • Petia Kovatcheva-Datchary,
  • Guido J. Bakker,
  • Stefan R. Havik,
  • Hilde Herrema,
  • Patrice D. Cani,
  • Kristien E. Bouter,
  • Clara Belzer,
  • Julia J. Witjes,
  • Anne Vrieze

Corecţie

30 ianuarie 2018: Personalul PLOS ONE (2018) Corecție: intestinal Ralstonia pickettii mărește intoleranța la glucoză în obezitate. PLOS ONE 13 (1): e0192339. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192339 Vizualizați corectarea

Cifre

Abstract

O compoziție modificată a microbiotei intestinale a fost implicată în patogeneza bolilor metabolice, inclusiv obezitatea și diabetul zaharat de tip 2 (T2DM). S-a sugerat că inflamația de nivel scăzut, potențial inițiată de microbiota intestinală, este o forță motrice în dezvoltarea rezistenței la insulină în obezitate. Aici, raportăm că ADN-ul bacterian este prezent în țesutul adipos mezenteric al subiecților umani obezi, dar altfel sănătoși. Pirosecvențierea genelor bacteriene 16S rRNA a arătat că ADN-ul din specia Gram-negativă Ralstonia era cel mai răspândit. Interesant este că abundența fecală de Ralstonia pickettii a fost crescută la subiecții obezi cu pre-diabet și T2DM. Pentru a evalua dacă R. pickettii a fost implicat în mod cauzal în dezvoltarea obezității și a T2DM, am efectuat un studiu de dovadă a conceptului la șoareci obezi induse de dietă (DIO). În comparație cu șoarecii martor tratați cu vehicul, șoarecii DIO tratați cu R. pickettii au toleranță redusă la glucoză. În plus, nivelurile circulante de endotoxină au fost crescute la șoarecii tratați cu R. pickettii. În concluzie, acest studiu sugerează că Ralstonia intestinală este crescută la subiecții umani obezi cu T2DM și înrăutățește reciproc toleranța la glucoză la șoarecii DIO.

Citare: Udayappan SD, Kovatcheva-Datchary P, Bakker GJ, Havik SR, Herrema H, Cani PD și colab. (2017) Ralstonia pickettii intestinale mărește intoleranța la glucoză în obezitate. PLoS ONE 12 (11): e0181693. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181693

Editor: Triantafyllos Chavakis, Universitatea Tehnică din Dresda, GERMANIA

Primit: 13 ianuarie 2017; Admis: 4 iulie 2017; Publicat: 22 noiembrie 2017

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante sunt incluse în hârtie, fișierele sale de informații suport și din Depozitul digital Dryad la https://doi.org/10.5061/dryad.q5s51.

Interese concurente: Avem următoarele interese. Acest studiu a fost parțial finanțat de asigurările AFA. M.N. și W.M.deV. sunt fondatori, capital propriu și se află în Consiliul consultativ științific al Caelus Pharmaceuticals, Olanda; WMdV se află în Consiliul consultativ științific al Chr Hansen Horsholm Danmark și al M.N. și W.M.deV. sunt fondatori, capital propriu și se află în Consiliul consultativ științific al Caelus Pharmaceutical (NIHS) Lausanne Elveția. F.B. este fondator al MetaboGen AB, Suedia. F.B. și G.B capital propriu în MetaboGen AB, Suedia. Niciuna dintre acestea nu este direct relevantă pentru lucrarea actuală. Nu există brevete, produse în curs de dezvoltare sau produse comercializate de declarat. Acest lucru nu modifică aderarea noastră la toate politicile PLOS ONE privind schimbul de date și materiale, așa cum este detaliat online în ghidul pentru autori.

Introducere

Epidemia mondială de obezitate, care este un factor de risc major pentru rezistența la insulină, determină dezvoltarea unor afecțiuni medicale comune, cum ar fi diabetul zaharat de tip 2 (T2DM), dislipidemia și bolile cardiovasculare [1]. Dezvoltarea obezității și a T2DM este complexă și este condusă atât de factori de mediu, cât și de factori genetici [2]. Modificările inflamatorii induse de obezitate în țesutul adipos alb au fost postulate pentru a juca un rol crucial în fiziopatologia obezității și T2DM. Deși majoritatea depozitului nostru de grăsime se află în țesutul adipos subcutanat, aproximativ 10-20% din masa totală a țesutului adipos este localizat intra-abdominal [3]. În special inflamația țesutului adipos visceral mezenteric este legată de rezistența la insulină reflectată în niveluri reduse de adiponectină plasmatică, care sunt asociate cu dezvoltarea rezistenței la insulină [4] și a influxului de macrofage [5]. La rândul său, rezistența la insulină se corelează cu reglarea în sus a genelor adipoase viscerale implicate în imunitatea înnăscută și inflamația [5].

Un număr tot mai mare de dovezi sugerează că compoziția microbiotei intestinale este legată de aportul de energie și obezitate [6] și de dezvoltarea inflamației cronice cu grad scăzut și a rezistenței la insulină [7, 8]. Acest lucru este susținut în continuare de datele care sugerează că endotoxinele (postprandiale) derivate din bacteriile intestinale Gram-negative sunt implicate în inflamația cronică scăzută și rezistența la insulină [9-11]. Într-adevăr, s-a constatat că gradul de endotoxemie prezice rezistența la insulină și dezvoltarea T2DM la subiecții obezi altfel sănătoși [12] printr-un proces despre care se crede că provine din afectarea funcției de barieră intestinală [13]. Studiile murine au arătat că macrofagele din țesutul adipos mezenteric conțin într-adevăr ADN bacterian care provine din intestin [14]. Cu toate acestea, rămâne de dovedit că bacteriile intestinale specifice sunt într-adevăr cauzale în patogeneza rezistenței la insulină [15].

Aici, raportăm că ADNr 16S bacterian, inclusiv cel al speciei Gram-negative Ralstonia, poate fi identificat în țesutul adipos visceral mezenteric al subiecților obezi umani care altfel erau sănătoși. În mod interesant, într-o cohortă separată de subiecți obezi cu T2DM, abundența fecală a Ralstonia pickettii a fost crescută comparativ cu martorii obezi non-diabetici. Pentru a evalua un potențial rol cauzal al R. pickettii în dezvoltarea unui fenotip asemănător diabetului zaharat într-un sistem model obez, am tratat șoareci obezi induse de dietă (DIO) cu R. pickettii timp de patru săptămâni. Interesant este că șoarecii DIO tratați cu R. pickettii au toleranță redusă la glucoză comparativ cu martorii tratați cu glicerol.

Rezultate

Identificarea ADN-ului bacterian Ralstonia în țesutul adipos visceral mezenteric de la indivizi obezi

ADNr 16S bacterian a fost amplificat prin PCR din ADN izolat din biopsiile de țesut adipos visceral mezenteric uman, în timp ce amplificarea PCR din biopsiile de țesut adipos omental sau subcutanat abia a dat niciun amplicon 16S rADN. Ampliconii din ADN-ul izolat din țesutul adipos mezenteric au fost supuși profilării cu electroforeză în gradient de denaturare (DGGE) (Fig. 1A). Secvențierea ulterioară a lui Sanger a identificat că banda dominantă a arătat cea mai mare similaritate cu Ralstonia spp. Analiza pirosecvențială a ampliconilor de ADNr 16S codați în bare obținute din același ADN, a identificat șapte genuri bacteriene în țesutul adipos visceral mezenteric de la oamenii obezi. Actinobacteriile au fost cele mai răspândite Gram-pozitive, iar Ralstonia, cele mai răspândite bacterii Gram-negative (Fig. 1B). Luând în considerare datele emergente din domeniu care sugerează că endotoxina derivată din bacteriile Gram-negative este implicată în endotoxemia metabolică și toleranța redusă la glucoză [9, 14, 16], pentru acest proiect ne-am concentrat pe rolul Ralstoniei în homeostazia glucozei.

În timpul perioadei de tratament de patru săptămâni, creșterea în greutate în HI-R. șoarecii DIO tratați cu pickettii au fost crescuți comparativ cu martorii tratați cu glicerol și R. pickettii (Fig. 2A). Este important să subliniem însă că HI-R. șoarecii DIO tratați cu pickettii au avut o greutate corporală ușor mai mare la începutul perioadei de tratament. Deși nu putem explica pe deplin această discrepanță, aceasta ar putea contribui parțial la creșterea relativă în greutate (Fig. 2B) la tratamentul cu HI R. pickettii. Compartimentul țesutului adipos alb epididimal (eWAT) a fost semnificativ crescut în HI-R. șoareci tratați cu pickettii în comparație cu glicerol și șoareci tratați cu R. pickettii, în timp ce compartimentele WAT mezenterice și renale nu difereau între grupuri (Fig. 2C). Conținutul de R. pickettii a fost crescut în fecalele de HI-R. șoareci tratați cu pickettii și R. pickettii în comparație cu martorii tratați cu glicerol (Fig 2D). În schimb, ADN-ul R. pickettii nu a crescut în țesutul adipos alb mezenteric (mWAT) al HI-R. șoarecii tratați cu pickettii în comparație cu martorii glicerol, în timp ce șoarecii tratați cu R. pickettii aveau niveluri crescute de ADN R. pickettii în acest compartiment al țesutului adipos (Fig. 2E). Acest lucru sugerează că bacteriile vii pot fi necesare pentru translocarea din intestin în concordanță cu o constatare anterioară (14).

Studiul DIWA (Fig. 1C și 1D) a inclus femei supraponderale (vârsta medie de 70 de ani, IMC 25,8-28 kg/m2) cu toleranță normală la glucoză (NGT), toleranță la glucoză afectată (IGT) sau diabet zaharat de tip 2 (T2DM) . Criteriile de excludere au fost bolile inflamatorii cronice și tratamentul cu antibiotice în ultimele trei luni. Mai multe detalii despre această cohortă au fost descrise în altă parte [7, 17]. Toți subiecții și-au dat consimțământul informat și au oferit un eșantion proaspăt de scaun de dimineață.

Animale

Șoarecii C56BL6/J masculi au fost obținuți de la Charles River Laboratories. Șoarecii au fost repartizați aleatoriu în grupurile de tratament. Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă standard de laborator (Research Diets Inc., SUA) sau cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) (60% Kcal grăsime, D12492, Research Diets Inc., SUA) așa cum este indicat în manuscris. Componentele dietetice ale HFD sunt prezentate în Tabelul 1.

Obezitatea indusă de dietă (DIO) a fost realizată prin hrănirea șoarecilor cu HFD timp de opt săptămâni, începând cu vârsta de patru săptămâni. Șoarecii au fost adăpostiți într-un ciclu constant de 12 ore lumină-întuneric cu temperatură și umiditate controlate și li s-a dat acces la alimente și apă ad libitum.

Începând cu vârsta de 13 săptămâni, Ralstonia pickettii (DSM 6297, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) a fost administrată zilnic timp de patru săptămâni prin gavaj oral (10 6 CFU în glicerol 10% în PBS, volumul final 100ul). S-au utilizat ca martori R. picketti (10 6 CFU în 10% glicerol-PBS, volumul final 100ul) și glicerol (10% în PBS, volumul final 100ul) inactivat termic (10 min la 70 ° C). Inactivarea prin căldură a afectat pe deplin capacitatea de creștere a lui R. pickettii (S2 Fig.). Viabilitatea și puritatea tuturor R. pickettii stocate la -80 ° C au fost testate până la 12 luni prin cultură și secvențiere. Creșterea în greutate și aportul de alimente au fost monitorizate pe toată durata tratamentului. Fecalele au fost colectate pe colivie (n = 5 șoareci pe colivie) în a treia săptămână de tratament.

Testele orale de toleranță la glucoză (OGTT) au fost efectuate în săptămâna a treia a perioadei de tratament. Șoarecii au fost posti timp de 4 ore și nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate de la vârful cozii. Șoarecii au primit un bolus oral de D-glucoză (2 g/kg greutate corporală în 200 l salină sterilă), iar nivelurile de glucoză din sânge au fost ulterior măsurate la t = 30, 60, 90 și 120 de minute.

După patru săptămâni de R. pickettii- sau tratament de control, șoarecii au fost terminați prin puncție cardiacă sub anestezie pentobarbitală de sodiu. Sângele a fost colectat în tuburi acoperite cu EDTA și a fost ținut pe gheață până la centrifugare (8.000xg, 4 ° C, 20min). Plasma a fost alicotată și utilizată pentru analiză imediat sau depozitată la -80 ° C. Organele și țesuturile, inclusiv țesutul adipos mezenteric (alinierea transversului colonului), au fost rapid excizate în condiții sterile, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la o analiză ulterioară.

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu principiile „Ghidului pentru îngrijirea și utilizarea animalelor experimentale” și au fost aprobate prospectiv de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor („Dierexperimentencommissie (DEC) al Centrului Medical Academic (AMC) din Amsterdam).

Izolarea și secvențierea ADN-ului bacterian

ADN-ul genomic atât de origine procariotă, cât și eucariotă a fost izolat din biopsii conform metodei fenol-coloform, așa cum este descris de Zoetendal și colab. [37]. Pe scurt, o cantitate standardizată de țesut adipos a fost tratată cu un amestec de SDS și proteinază K la 55 ° C și omogenizată prin întrerupere mecanică folosind margele de sticlă de zirconiu (1 mm) în FAST Prep-24 (MP Biomedical) în prezența fenolului . ADN-ul genomic a fost extras folosind o serie de extracții de fenol/cloroform și precipitat în prezența etanolului absolut.

Mai mult, ADN-ul genomic a fost supus 454-pirozecvențării regiunii V4-V6 a ARNr-ului 16S (folosind primerii 520F 5'- AYT GGG YDT AAA GNG -3 'și 1100R 5'- GGG TTN CGN TCG TTG -3') . Citirile controlate de calitate (normalizate la cel puțin 1000 de citiri pe eșantion) au fost procesate prin conducta QIIME [40]. Pentru a cuantifica Ralstonia-spp. bacterii, am efectuat un qPCR în probele de ADN fecal și ADN mWAT [41]. Probele au fost analizate într-un amestec de reacție de 25 μl format din 12,5 μl 1xSYBR Green Master Mix tampon (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, SUA), apă, 0,2 μM din fiecare primer și 5 μl de șablon de ADN genomic extras din fecale sau mWAT. Curba standard a produsului 16R rRNA PCR al Ralstonia pickettii a fost creată utilizând o diluție serială de 10 ori a produsului purificat 16S rRNA PCR cu lungime completă. Primerii qPCR s-au bazat pe R. pickettii (F ’: ATGATCTAGC-TTGCTAGATTGAT; R’: ACTGATCGTCGCCTTGGTG). Datele sunt exprimate ca copii ale ADN-ului 16S Ralstonia comparativ cu ADN-ul bacterian total [42].

Măsurarea endotoxinelor plasmatice

Activitatea endotoxinei LPS din sânge a fost măsurată utilizând Endosafe-MCS (Charles River Laboratories, Lyon, Franța) pe baza metodologiei cromogenice cinetice Limulus amaebocyte Lysate (LAL) care măsoară intensitatea culorii direct legată de concentrația de endotoxină dintr-o probă. Plasma a fost diluată 1/10 cu tampon fără endotoxine (Charles River Laboratories) pentru a minimiza interferențele în reacție și a fost încălzită timp de 15 minute la 70 ° C. Fiecare probă a fost diluată cu apă reactivă LAL fără endotoxine (Charles River Laboratories) și tratată în duplicat. Două vârfuri pentru fiecare probă au fost incluse în determinare. Toate probele au fost validate pentru recuperare și variația coeficientului. Limita inferioară de detectare a fost de 0,005 EU/ml [43].

PCR cantitativ în timp real.

Secțiunile de țesut adipos de șoarece (mezenteric și epididim) au fost omogenizate folosind țesutul-magnaLyzer (Roche, Elveția). ARN-ul total a fost extras folosind reactiv tri-pur (Roche). ADNc a fost preparat prin transcriere inversă a 1μg ARN total utilizând un kit de transcriere inversă (BioRad, SUA). QPCR în timp real a fost efectuat utilizând master mix Sensifast SYBR (GC biotech). Au fost folosiți primerii de întindere la limită intron-exon specific genei și toate rezultatele au fost normalizate la gena de păstrare a casei 36B4. Toate probele au fost analizate în duplicat, iar datele au fost analizate conform metodei 2 ΔΔCT.

analize statistice