Neelendu Dey

1 Centrul de Științe ale Genomului și Biologie a Sistemelor, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

2 Center for Gut Microbiome and Nutrition Research, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

3 Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis, MO 63108, SUA

Vitas E. Wagner

1 Centrul de Științe ale Genomului și Biologie a Sistemelor, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

2 Center for Gut Microbiome and Nutrition Research, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

Laura V. Blanton

1 Centrul de Științe ale Genomului și Biologie a Sistemelor, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

2 Center for Gut Microbiome and Nutrition Research, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

Jiye Cheng

1 Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

2 Center for Gut Microbiome and Nutrition Research, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

Luigi Fontana

3 Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis, MO 63108, SUA

Rashidul Haque

4 Center for Nutrition and Food Security, International Center for Diarrheal Disease Research, Dhaka 1212, Bangladesh

Tahmeed Ahmed

4 Center for Nutrition and Food Security, International Center for Diarrheal Disease Research, Dhaka 1212, Bangladesh

Jeffrey I. Gordon

1 Centrul de Științe ale Genomului și Biologie a Sistemelor, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

2 Center for Gut Microbiome and Nutrition Research, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, SUA

Date asociate

REZUMAT

Pentru a înțelege modul în care diferitele diete, microbiota intestinală a consumatorilor și sistemul nervos enteric (ENS) interacționează pentru a regla motilitatea intestinului, am dezvoltat un model de șoarece gnotobiotic care imită schimbările dietetice pe termen scurt care apar atunci când oamenii călătoresc în locuri cu tradiții culinare diferite. . Studiind animale transplantate cu microbiota de la oameni reprezentând fiecare bucătărie și hrănite cu o secvență de diete reprezentând cele ale tuturor donatorilor, constatăm că corelațiile dintre abundența speciilor bacteriene și timpul de tranzit sunt dependente de dietă. Cu toate acestea, nivelurile de acizi biliari neconjugați - care reflectă activitatea microbiană a sării de bilă hidrolază - se corelează cu tranzitul mai rapid între diete, inclusiv o dietă din Bangladesh. Șoarecii care adăpostesc un consorțiu de tulpini bacteriene secvențiate din microbiota donatorului din Bangladesh și care au hrănit o dietă din Bangladesh au arătat că condimentele utilizate în mod obișnuit, curcuma, încetinesc timpul de tranzit. Curcuma afectează motilitatea intestinului prin deconjugarea bacteriană a acidului biliar și modularea semnalizării Ret în ENS. Aceste rezultate demonstrează modul în care un singur ingredient alimentar interacționează cu o trăsătură funcțională de microbiotă pentru a regla fiziologia gazdei.

Abstract grafic

intestinale

INTRODUCERE

Motilitatea intestinală, un parametru fiziologic cheie care reglementează digestia și absorbția nutrienților, este afectată de dietă (Cummings și colab., 1976, 1978), de microbi intestinali (Husebye și colab., 1994, 2001; Wichmann și colab., 2013), sistemul nervos enteric (ENS) (Edery și colab., 1994; Romeo și colab., 1994) și genetica gazdei (Levy și colab., 2000; Whorwell și colab., 1986). În prezent, ne lipsește o înțelegere detaliată a relațiilor complexe și dinamice dintre acești factori, în special în contextul global al diverselor tradiții culturale referitoare la alimente, metodele lor de preparare și microbiota intestinală variată care a evoluat în aceste condiții dietetice. Timpii de tranzit intestinal măsurați la> 1000 de indivizi sănătoși, reprezentând diverse populații din întreaga lume, au variat în cadrul și între grupuri, reflectând probabil un punct culminant al acestor factori (Burkitt și colab., 1972). Apariția metodelor independente de cultură pentru caracterizarea structurii și funcțiilor exprimate ale unei microbiote intestinale creează o oportunitate de a identifica noi abordări pentru înțelegerea motilității intestinale și pentru optimizarea beneficiilor nutriționale derivate din diferite practici dietetice.

REZULTATE

Modelarea dietei și a modificărilor motilității asociate cu călătoriile umane globale la șoareci gnotobiotici

În prim-plan, norii de cuvinte transmit ingredientele specifice utilizate: dimensiunile fonturilor reprezintă reprezentările proporționale pe bază de greutate ale ingredientelor din fiecare dietă. Diagramele pie în fundal prezintă compozițiile macromoleculare. Vezi și Tabelul S1.

Agregarea datelor de la toate animalele în toate momentele acestui experiment de călătorie în 6 faze a relevat o distribuție normală a timpilor de tranzit (Figura 2C). Varianța medie a mouse-ului pe tot parcursul experimentului a fost de 27,7 minute, în timp ce varianța medie între șoarece la un moment dat a fost de 29,3 minute. Măsurile repetate ANOVA în care timpul de tranzit a fost variabila dependentă au demonstrat că dieta (p = 5,6 × 10 -5), microbiota donatorului (p = 2,3 × 10 −3) și interacțiunea dietei și microbiotei (p = 2,6 × 10 −3) au fost toți factorii semnificativi (Tabelul S3A). Cele mai contrastate efecte dietă-microbiotă asupra timpilor de tranzit au fost documentate la șoarecii colonizați cu Bangladesh-ul, comparativ cu microbiota restricționată în SUA atunci când au consumat diete din Bangladesh și primare (Figura 2D). Mai exact, șoarecii colonizați cu microbiota restricționată în SUA au avut o motilitate semnificativ mai rapidă (adică, timpi de tranzit mai mici) atunci când consumă dieta din Bangladesh comparativ cu dieta primară (p -5, F = 19,8, ANCOVA), deși dimensiunea efectului și semnificația statistică a diferențelor în timpul de tranzit variat în funcție de microbiota donatorului individual (Figura S1B, Tabelul S2B).

Corelațiile dintre abundențele relative ale tulpinilor bacteriene intestinale și timpii de tranzit sunt dependente de dietă

Pentru a identifica relațiile dintre taxele bacteriene specifice, dieta și fenotipurile timpului de tranzit, am secvențiat ampliconi PCR generați din regiunea V4 a genelor ARNr bacteriene 16S prezente în microbiota fecală colectate pe parcursul parcurgerii a 6 faze, precum și a experimentelor de călătorie în 3 faze. (984 probe fecale; 22.470 ± 630 citiri pe probă [medie ± sem]; Tabelul S4). Citirile ARNr 16S au fost grupate în unități taxonomice operaționale, în funcție de faptul că au împărțit identitatea secvenței de nucleotide ≥97% (97% ID OTU). Analiza principală a coordonatelor (PCoA) bazată pe UniFrac, o metrică filogenetică care calculează similitudinea între oricare două microbiote pe baza gradului în care OTU-urile lor componente împart lungimea ramurii pe un arbore bacterian (Lozupone și Knight, 2005), a indicat faptul că asamblarea comunității a fost rapid și foarte reproductibil într-un anumit grup de șoareci care au primit aceeași microbiotă de donator atât în ​​experimentele de călătorie în 6 faze, cât și în 3 faze (Figura S2A, C).

Microbiota donatorului a fost factorul predominant care explică varianța distanțelor UniFrac neponderate între probele din diferitele grupuri experimentale (p Figura 3; Tabelul S5). Am ales să aplicăm un algoritm bazat pe arborele decizional pentru selectarea caracteristicilor (adică, în acest caz, cele mai discriminatorii OTU-uri dietetice), astfel încât să nu fim nevoiți să facem nicio ipoteză distributivă cu privire la setul nostru de date despre abundențele OTU proporționale. Modelul derivat din Random Forests a prezis care dietă se consuma în experimentul de călătorie în 3 faze ulterior cu o precizie medie de 83% ± 0,02% (interval 79% -86%; 10.000 replicări), semnificativ mai bună decât distribuția nulă −16 ). Aceste 87 OTU-uri discriminatorii pentru dietă nu au fost corelate semnificativ cu timpul de tranzit în niciun experiment. Într-o analiză a tuturor celor 416 97% OTU ID cu abundențe relative peste limita de detectare (0,01%) în probele de fecale de șoarece colectate pe parcursul ambelor experimente de călătorie, doar o singură OTU, Parabacteroides gordonii (OTU ID 240), a fost semnificativ corelată, după Corecția Bonferroni pentru comparații multiple, cu timpi de tranzit între combinațiile foarte contrastate dieta-microbiota (rho = 0,3, p = 0,02). Nu s-a raportat că acest organism este asociat cu modificarea motilității intestinale la om.

(A) Ratele de eroare estimate în afara pungii într-un model de păduri aleatorii pentru prezicerea dietei, stratificat în funcție de microbiota donatorului, în funcție de numărul de OTU-uri discriminatorii pentru dietă. Pentru fiecare microbiota, 40 OTU au fost suficiente pentru a discrimina dieta, rezultând un total de 87 OTU-uri unice în șase donatori de microbiota din cinci tradiții culturale/dietetice în experimentul de călătorie în 6 faze. (B) Dovezi pentru robustețea OTU-urilor care discriminează dieta la microbiota donatorului și la fenotipul motilității. Scorurile de importanță ale caracteristicii a 87 de OTU discriminatorii în dietă în fiecare context de dietă-microbiotă sunt reprezentate în această hartă de căldură. Un model de păduri aleatorii rare, construit folosind aceste OTU discriminatorii pentru dietă, a prezis cu precizie dieta în experimentul de călătorie în 3 faze. Vezi și Tabelul S5.

În schimb, 27 OTU prezente atât în ​​microbiota restricționată în SUA, cât și în cea din Bangladesh au avut corelații semnificative dependente de dietă cu timpii de tranzit documentați în contextul dietelor din Bangladesh sau din cele primare, dar nu și în ambele (Tabelul S3B). Relațiile bacteriilor cu timpul de tranzit au fost specifice tulpinii: două tulpini de Eubacterium desmolans (ID-urile OTU 170124 și 158946) au avut relații opuse cu timpii de tranzit în cadrul consumului de dietă primară. Un singur OTU, E. desmolans (OTU ID 158946), a fost semnificativ corelat cu timpii de tranzit în ambele diete, dar în mod remarcabil, corelațiile au fost opuse în contextele dietei din Bangladesh față de dieta primară (p −6, F = 9.6, interacțiunea de testare ANCOVA a E .abundenta desmolans cu dieta). În contextul fără restricții ale dietei SUA, încă o OTU în microbiota fără restricții și în Bangladesh (Clostridiales, OTU ID 261590) a fost corelată cu timpii de tranzit (rho = -0,57, p = 0,04). Prin urmare, o ipotetică tulpină probiotică de generația următoare concepută să aibă impact asupra motilității ar necesita probabil consumul simultan al unei diete specifice sau a unui ingredient din dietă pentru a-și exercita efectul, la fel cum s-a demonstrat că microbii care conferă slăbiciune își transmit fenotipul într-un mod dependent de dietă ( Ridaura și colab., 2013).

Profilarea metabolitului acidului biliar și analiza ARNr 16S au fost efectuate pe probe fecale colectate de la șoareci în experimentul de călătorie în 3 faze (Figura S1). Corelațiile Spearman au fost calculate între concentrațiile de acid biliar și abundențele relative de 97% OTU. A fost aplicat un cluster ierarhic nesupravegheat. Asocieri semnificative (p −6, p −7 și p −5 pentru fazele de dietă 1, 2 și, respectiv, 3, testul t Student cu două cozi; Tabelul S2C). Consumul de turmeric a fost asociat cu o încetinire semnificativă a motilității (adică, un timp de tranzit mai lung) (Tabelul S2C). UPLC-MS de probe fecale colectate de la șoareci fără germeni la sfârșitul fiecărei faze de dietă a dezvăluit că ingestia acestui condiment colekinetic a fost asociată cu niveluri semnificativ crescute de acid taurohidodeoxicolic (p = 0,003, testul t cu o singură coadă Student) și tauro -sulfat de acid muricolic (p = 0,03, testul t cu o singură coadă al studentului) comparativ cu perioada de consum dietetic nesuplimentat (Tabelul S6A). Așa cum era de așteptat, nu au fost detectați acizi biliari neconjugați în grupul fără germeni în timpul oricăreia dintre fazele dietei. Am inclus un standard de curcumină pentru a cuantifica nivelurile de curcumină fecală; cu toate acestea, curcumina a fost nedetectabilă în toate probele.

Efectele turmericului asupra expresiei genei gazdei

Interacțiunea microbiotei, a acizilor biliari și a ENS

Pentru a evalua gradul în care efectul turmericului asupra motilității a fost dependent de semnalizarea bazată pe ENS (Alemi și colab., 2013), am apelat la șoareci heterozigoți pentru o alelă nulă a receptorului Ret (Tsuzuki și colab., 1995). Ret, care codifică o proteină transmembranară care leagă liganzii familiei factorului neurotrofic derivat din celule gliale, este gena cel mai frecvent implicată în boala Hirschsprung (Edery și colab., 1994; Romeo și colab., 1994), o tulburare de dezvoltare asociată cu peristaltismul absent în colonul distal. Heuckeroth și colegii săi au raportat că șoarecii Ret +/− prezintă reduceri de> 90% ale contractilității musculaturii intestinale longitudinale și circulare și reduceri de 70-95% în eliberarea a doi neurotransmițători (substanța P și VIP) comparativ cu animalele Ret +/+, în ciuda faptului că au numere echivalente de neuroni enterici (Gianino și colab., 2003). Am constatat că șoarecii de tip sălbatic crescuți în mod convențional (Ret +/+) au timp de tranzit semnificativ mai lent decât colegii lor de litiere heterozigoți (Ret +/−) crescuți în mod convențional (p = 0,05, testul t al studentului cu o coadă; Tabelul S2F).

DISCUŢIE

Alte ingrediente dietetice (de exemplu, polizaharide (Kashyap și colab., 2013)) și produse de metabolism bacterian (de exemplu, butiratul (Soret și colab., 2010)) au fost descrise anterior pentru a afecta motilitatea la modelele de șoareci. Populațiile care se confruntă cu schimbări ale tradițiilor culturale/culinare prin călătorii, imigrație sau emigrare, sunt susceptibile la modificări semnificative ale microbiotei intestinale, atât structurale, cât și funcționale, care pot avea consecințe de sănătate în aval. În principiu, abordarea noastră ar putea fi utilizată pentru a identifica și caracteriza activitățile biologice și interacțiunile microbiote ale componentelor dietetice caracteristice tradițiilor dietetice/culturale stabilite de-a lungul secolelor, dar acum vulnerabile la utilizarea diminuată din cauza occidentalizării. Excluderea lor din dietele moderne poate reprezenta o pierdere a ingredientelor alimentare cheie care ar putea fi folosite pentru a promova sănătatea în societățile contemporane. Aceste ingrediente pot servi, de asemenea, ca instrumente valoroase pentru identificarea și caracterizarea mecanismelor prin care alimentele și microbiota interacționează pentru a afecta diverse caracteristici ale fiziologiei noastre.

PROCEDURI EXPERIMENTALE

Măsurarea timpilor de tranzit gastro-intestinal utilizând colorant roșu carmin neabsorbabil

Roșu carmin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a fost preparat ca o soluție de 6% (greutate/volum) în 0,5% metilceluloză (Sigma-Aldrich) și autoclavizat înainte de importul în izolatori gnotobiotici. Șoarecii au fost menținuți pe un ciclu de lumină strict de 12 ore (luminile aprinse între 06:00 și 18:00) și gavate cu 150 μL de soluție de carmin între orele 08:00 și 08:30, ora locală. Animalele nu au fost postite în prealabil. Fecalele au fost colectate la fiecare 30 de minute (până la 8 ore de la momentul gavajului) și striate pe un șervețel alb steril pentru a testa prezența colorantului carmin roșu. Timpul de la gavaj până la apariția inițială a carminului în fecale a fost înregistrat ca timpul total de tranzit intestinal pentru acel animal.

Generarea unei colecții de culturi clonalizate cu tulpini bacteriene anaerobe din microbiota fecală a unui copil din Bangladesh, sănătos, în vârstă de 24 de luni

Testele in vitro pentru deconjugarea acidului biliar

Evidențierea articolului

Motilitatea intestinului este afectată de diferite combinații de microbiote intestinale umane prin dietă (81 de caractere)

Curcuma încetinește motilitatea la șoarecii gnotobiotici cu o microbiotă/dietă din Bangladesh (80 de caractere)

Efectul turmericului implică secreția/deconjugarea acidului biliar și semnalizarea Ret (78 de caractere)

Șoarecii gnotobiotici pot defini interacțiunile cheie dintre alimentele tradiționale și microbiota (85 de caractere)