Contribuție de Salih J. Wakil, 17 iunie 2003

mutanți

Abstract

La animale, inclusiv la oameni, există două izoforme majore ale acetil-CoA carboxilazei, ACC1 (Mr ≈ 265.000) și ACC2 (Mr ≈ 280.000), care sunt codificate de gene separate și prezintă distribuție distinctă a țesuturilor și celulare (1-4). ADNc-urile care codifică ACC1 și ACC2 uman au fost clonate și secvențiate (1, 2, 5), iar secvențele de aminoacizi prezise au arătat omologii ridicate între cele două izoforme, cu excepția celor 114 aa suplimentare prezente în capătul N terminal al ACC2. Primii 20 aa din această peptidă suplimentară sunt foarte hidrofobi și sunt responsabili de ghidarea ACC2 către membrana mitocondrială (6). Pe de altă parte, ACC1 nu are peptida N-terminală hidrofobă și s-a dovedit a fi localizat în citosol (6). În ficat și alte țesuturi lipogene, ACC1 este extrem de exprimat, iar malonil-CoA pe care îl generează este sursa unităților C2 pentru sinteza acizilor grași. În inimă, mușchi și ficat, malonil-CoA generat de ACC2 este probabil regulatorul sistemului de navetă carnitină/palmitoil-CoA asociat cu membrana mitocondrială (7).

Recent am prezentat dovezi că ACC1 este localizat la citosol și ACC2 este asociat cu membrana mitocondrială (7). În plus, am arătat că șoarecii mutanți Acc2-nuli care conțin ACC1 funcțional au niveluri ridicate de oxidare a acizilor grași (8). Aceste rezultate susțin opinia că malonil-CoA celular este compartimentat; malonil-CoA sintetizat de ACC1 este utilizat în sinteza acizilor grași, în timp ce malonil-CoA generat de ACC2 este implicat în controlul oxidării acizilor grași (8). Pentru a înțelege rolul pe care îl joacă ACC2 în obezitate și diabetul de tip 2, am hrănit șoareci mutanți WT și Acc2 cu diete care induc obezitatea. Rezultatele prezentate aici indică faptul că, în timp ce șoarecii WT au devenit obezi și diabetici, oxidarea crescută a acizilor grași la șoarecii mutanți Acc2-nul a redus obezitatea și a împiedicat apariția diabetului de tip 2.

Materiale și metode

Generarea și întreținerea șoarecilor cu deficit de ACC2. Strategia utilizată pentru a genera șoareci Acc2-nul a fost descrisă și raportată (8). Șoarecii mutanți și WT au fost menținuți, adăpostiți și păstrați pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și au avut acces ad libitum la chow normal (Purina) sau la o dietă bogată în grăsimi/bogată în carbohidrați (32% din calorii provin din grăsimi și 38% provin din carbohidrați) sau o dietă bogată în grăsimi (45% din caloriile din grăsimi) (Bioserv, Frenchtown, NJ). Creșterea în greutate corporală a fost determinată prin cântărirea șoarecilor săptămânal.

i.p. Test de toleranță la glucoză. Șoarecii cărora li s-a administrat o dietă bogată în grăsimi/carbohidrați timp de 4 luni au fost postiti timp de 6-8 ore, iar glucoza (1 g/kg greutate corporala) a fost injectata i.p. Nivelurile de glucoză au fost măsurate din sângerările din coadă cu un glucometru (Abbott) și/sau metoda glucozei oxidazei (Sigma) la 0, 15, 30, 60 și 120 min după injectarea glucozei. În plus, corpurile cetonice (β-hidroxibutirat) au fost determinate așa cum s-a descris anterior (8). Nivelurile serice de insulină au fost măsurate, în dublu exemplar, pe 5 μl de ser prelevat din sânge recoltat din vena cozii utilizând kitul ELISA pentru insulină de șobolan (Crystal Chem, Chicago), conform recomandărilor producătorului.

Determinarea conținutului de grăsime la șoareci vii. Spectrometrul Minispec RMN cu rezoluție mică de 60 MHz, EchoMRI (Bruker Optics, Billerica, MA) sau metodele de absorbție cu raze X cu energie duală au fost utilizate pentru cuantificarea grăsimii la șoareci vii. Șoarecii utilizați pentru absorptiometria cu raze X au fost anesteziați și scanați de trei ori folosind un densitometru periferic (PIXImus lunar).

Oxidarea acidului gras în hepatocite și în mușchiul Soleus. Hepatocitele din ficatul de șoareci WT în vârstă de 3 până la 4 luni și șoareci mutanți Acc2 -/- au fost izolate după perfuzia colagenazei (15). Celulele au fost placate la o densitate de ~ 105 celule per godeu în mediu conținând 10% FBS. După incubări de 2 ore, mediul a fost înlocuit cu mediul Williams și celulele au fost incubate peste noapte la 37 ° C sub o atmosferă umidificată 95% aer2/5% CO2 atmosferă.

Pentru izolarea mușchilor solei, șoarecii au fost uciși prin dislocare cervicală și s-au obținut două benzi de mușchi solei de la fiecare animal. Β-oxidarea acizilor grași a fost determinată în conformitate cu Alam și Saggerson (16), cu excepția faptului că [3 H] palmitat a fost utilizat ca substrat pentru β-oxidare (17).

Pentru pregătirea și măsurarea oxidării acizilor grași în hepatocite, a fost urmată procedura Moon și Rhead (18). Hepatocitele au fost cultivate în plăci cu șase godeuri timp de 24 de ore și spălate de două ori cu PBS Dulbecco înainte de a fi testate pentru oxidarea acizilor grași. Reacția a fost efectuată în triplicat (250 μl per godeu) fiecare conținând 22 μM [9,10 (n) - 3 H] palmitat [53 Ci (1 Ci = 37 GBq)/mmol], care a fost preparat după îndepărtarea completă a solventul sub un curent de aer conținând 5% CO2 și reziduul a fost suspendat în soluția de sare echilibrată a Hanks (HBSS) conținând 10 mg/ml BSA. După incubare de 1 oră la 37 ° C sub aer umidificat conținând 5% CO2, mediul de reacție a fost transferat în tuburi de centrifugare și 2,5 ml de metanol/cloroform (2: 1) și 1 ml de 2 M KCl/2 M HCI au fost adăugat. După amestecarea energică a reacțiilor, amestecurile au fost centrifugate la 3.000 × g timp de 5 minute, iar faza apoasă (1 ml) conținând 3 H2O a fost transferată într-un tub nou, tratat încă o dată cu metanol/cloroform și KCl/HCl amestec, și recuperat, iar radioactivitatea a fost măsurată.

Activitatea Carnitinei Palmitoyl-CoA Transferaza 1 (CPT1) în mitocondriile musculare scheletice. Mitocondriile musculare au fost izolate așa cum a fost descris de Cakes și colab. (19) cu unele modificări. Mușchii scheletici (gastrocnemius și soleus) au fost disecați și așezați imediat într-un mediu răcit conținând 300 mM zaharoză, 5 mM Tris · HCI și 1 mM EGTA, pH 7,4. Țesutul a fost tocat cu foarfece, resuspendat în 10 vol din același mediu și omogenizat utilizând un amestecător mecanic de țesut Kinematica Polytron cu două rafale de 5 secunde (viteză medie). Mitocondriile au fost apoi izolate utilizând aceeași procedură descrisă pentru izolarea mitocondriilor hepatice (20), cu excepția faptului că ultima etapă de centrifugare printr-o coloană de zaharoză cu densitate mare a fost omisă. Peletele mitocondriale au fost în cele din urmă suspendate în 1-3 ml dintr-un mediu care conține 150 mM KCl, 5 mM Tris · HCI și 1 mM EGTA (pH 7,4) la o concentrație de 15 mg de proteină mitocondrială per ml și utilizate imediat pentru testul CPT1 ( 21).

Activitatea CPT1 în hepatocite. Activitatea CPT1 a hepatocitelor a fost măsurată așa cum a fost descris de Sleboda și colab. (22) cu unele modificări. Hepatocitele au fost placate ca 1 × 106 celule pe godeu în DMEM cu 10% FBS în plăci cu șase godeuri. După incubare timp de 4 h, mediul a fost îndepărtat, celulele au fost spălate cu PBS și mediul a fost înlocuit cu 0,7 ml mediu de testare constând din 50 mM imidazol, 70 mM KCl, 80 mM zaharoză, 1 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM KCN, 1 mM ATP, 0,1% BSA fără acizi grași, 70 μM palmitoil-CoA, 1 μCi de l - [3 H] carnitină și 40 μg de digitonină cu sau fără 50 μM malonil- CoA. După ce celulele au fost incubate timp de 6 minute, reacția a fost oprită prin adăugarea a 0,5 ml de acid percloric rece cu gheață 4 M. Amestecul a fost centrifugat la 8.000 × g timp de 10 min și peleta a fost spălată cu 0,5 ml de acid percloric 2 mM, resuspendată în 800 pl de H2O și extrasă cu 400 pl de n-butanol, iar radioactivitatea în 180 pl de butanol a fost determinată de numărarea scintilației lichide.

Analiza Northern Blot. ARN-ul total a fost izolat din diferite țesuturi utilizând reactiv TRI (Sigma) și o probă de 6 până la 8-μg a fost supusă electroforezei cu gel de agaroză 1% în prezența formalinei. ARN-ul fracționat a fost transferat la filtrele Hybond N (Amersham Pharmacia) și hibridizat cu 32 de sonde ADNc proteice de decuplare (UCP) marcate cu P utilizând kitul NorthernMax (Ambion, Austin, TX). ADNc-urile pentru UCP1 (400 bp), UCP2 (510 bp) și UCP3 (317 bp) au fost generate utilizând secvențele de la GenBank cu numerele de acces U009463.1, U69135.1 și, respectiv, U63418.1. ADNc pentru ARN ribozomal 18S a fost utilizat pentru a normaliza încărcarea ARN.

Rezultate si discutii

Greutatea corporală a șoarecilor WT și Acc2 -/- mutanți (mt) hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi/bogată în carbohidrați. (A) Șoarecii masculi și femele de șapte până la 8 săptămâni (n = 9) au fost hrăniți cu o dietă specială (32% din calorii din grăsimi și 38% din carbohidrați) timp de 24 de săptămâni. Greutatea fiecărui șoarece în cadrul fiecărui grup a fost măsurată săptămânal; sunt arătate media și varianța greutăților. (B) Cuantificarea greutății corporale totale și a componentelor grase și slabe la șoareci vii în A folosind metodele de absorbție cu raze X cu energie duală descrise în Materiale și metode. Barele umplute reprezintă mutante și barele goale reprezintă WT. *, P -/- mutant.