Harel Eitam

1 Institutul de Științe Animale, Departamentul de Științe și Genetică a Ruminantelor, Centrul de Cercetare Newe Ya’ar, Organizația de Cercetări Agricole, P.O. Caseta 1021, Ramat Yishay, 30095 Israel

grăsimilor

2 Departamentul de Biologie Evolutivă și de Mediu, Facultatea de Știință și Educație Științifică, Universitatea din Haifa, Haifa, 31905 Israel

Arieh Brosh

1 Institutul de Științe Animale, Departamentul de Științe și Genetică a Ruminantelor, Centrul de Cercetare Newe Ya’ar, Organizația de Cercetări Agricole, P.O. Caseta 1021, Ramat Yishay, 30095 Israel

Alla Orlov

1 Institutul de Științe Animale, Departamentul de Științe și Genetică a Ruminantelor, Centrul de Cercetare Newe Ya’ar, Organizația de Cercetare Agricolă, P.O. Caseta 1021, Ramat Yishay, 30095 Israel

Ido Izhaki

3 Departamentul de Biologie Evolutivă și de Mediu, Facultatea de Științe și Educație Științifică, Universitatea din Haifa, 31905 Haifa, Israel

Ariel Shabtay

1 Institutul de Științe Animale, Departamentul de Științe și Genetică a Ruminantelor, Centrul de Cercetare Newe Ya’ar, Organizația de Cercetare Agricolă, P.O. Caseta 1021, Ramat Yishay, 30095 Israel

Abstract

Introducere

În regiunea mediteraneană, precum și în multe țări din întreaga lume, efectivele de vite de vită sunt cultivate sub un regim extins. Ecosistemele mediteraneene se disting prin sezonalitate ridicată în ceea ce privește disponibilitatea resurselor (Sternberg et al. 2000). Acest lucru implică faptul că bovinele de vită cu pășunat liber se pot confrunta cu o reducere a calității nutriționale a furajelor prin ingredientele sale chimice, digestibilitatea și energia metabolizată, în special în timpul anotimpurilor calde și uscate (Aharoni și colab. 2004; Brosh și colab. 2004) care poate dura până la 8 luni (Main 1986).

Furajele de slabă calitate pot afecta în mod dăunător reproducerea (Randel 1990) și, de asemenea, pot interfera cu succesul înțărcării vițeilor prin efectul său negativ asupra producției de lapte. Într-adevăr, în ultimele două decenii s-a înregistrat o scădere semnificativă continuă a producției de vițel a efectivelor de bovine cu pășunat liber, în Israel în ultimele două decenii (Ungar și colab. 2005). Deoarece nivelurile scăzute ale consumului de energie scurtează durata și afectează în mod negativ producțiile totale de lapte în timpul perioadei de lactație (Jenkins și Ferrell 1992) și prelungesc perioada de la fătare la primul est postpartum (Randel 1990), este foarte probabil ca scăderea continuă în producția de vițel poate proveni din efectele adverse ale calității furajelor reduse asupra caracteristicilor laptelui la vacile de vită care alăptează.

De asemenea, bovinele de lapte pot prezenta stres caloric (cetoza). Cetoza apare în primele 2 luni după fătare și este cauzată de un echilibru energetic negativ sever care rezultă din producția ridicată de lapte, aportul insuficient de energie și mobilizarea excesivă a grăsimii corporale (de Roos și colab. 2007). În ultimele secole, vacile de lapte au fost selectate pentru un randament ridicat de lapte, indiferent de cerințele nutriționale efective ale vițelului care alăptează. Comparând răspunsurile vacilor de vită și de lapte cu stresul caloric și/sau cetoza, poate fi posibil să se urmărească dacă modificările caracteristicilor laptelui reflectă mecanisme evolutive prin care vacile care alăptează au făcut față provocărilor nutriționale din habitatul lor.

La nivel celular, inducerea proteinei de șoc termic 70 (Hsp70) a fost asociată cu dezvoltarea toleranței la stresul caloric (Kregel 2002). Hsp70 este un membru al super-familiei Hsp care prin sinteză rapidă, specifică și masivă ajută organismele să facă față diferitelor stresuri (Craig și Lindquist 1988; Welch 1990). Cu toate acestea, membrii acestei familii Hsp sunt prezenți constitutiv în celule. Familiile Hsp induse și exprimate constitutiv sunt bine cunoscute sub numele de chaperone moleculare care ajută la plierea normală a diferitelor polipeptide, ajută proteinele pliate greșit să obțină sau să recâștige stările lor native, reglează degradarea proteinelor și ajută la translocarea proteinelor în diferite compartimente celulare (Hartl și Hayer-Hartl 2002; Kovacs și colab. 2005).

Producția de lapte la bovine de vită este considerată determinantul major al efectelor materne asupra ratei de creștere a vițeilor până la înțărcare (Meyer și colab. 1994). Laptele afectează foarte mult performanța vițelului și nevoile nutriționale ale barajului, afectând astfel indirect și ratele de reîncărcare (Mallinckrodt și colab. 1993).

În lumina celor de mai sus, dezvoltarea unui indice fiziologic și molecular care ar servi pentru a testa răspunsul vacilor de vită care alăptează liber la stresul caloric atât la nivel productiv, cât și la nivel de auto-protecție este inevitabil. Un astfel de indice poate fi de mare ajutor atunci când vine să testeze adecvarea raselor de bovine de vită la habitate provocatoare de nutriție. Prezentul studiu se concentrează pe răspunsurile compensatorii ale vacilor de vită care alăptează la un consum pe termen lung de dietă cu conținut scăzut de energie și proteine, prin studierea producției și caracteristicilor laptelui (conținut, compoziție a acizilor grași) și a expresiei genice a celulelor somatice din lapte. Unele dintre aceste răspunsuri (randamentul laptelui, compoziția acizilor grași și expresia proteinelor în celulele somatice din lapte) sunt comparate cu vacile lactate ketotice.

Materiale și metode

Animale și tratamente

Experimentul 2 Pentru a studia efectul cetozei asupra caracteristicilor grăsimii din lapte la vacile de lapte, laptele proaspăt a fost prelevat din șase vaci martor și zece vaci Holstein - Friesian ketotice de la o fermă comercială de lapte (Kibutz Yifat). Postcalving, vacile martor și ketotice au fost hrănite cu o dietă identică, cu ME - 2,78 Mcal/kgDM și CP - 18%, din care 51% au fost degradabile. Statutul cetotic a fost determinat de un medic veterinar, utilizând analiza corpurilor cetonice urinare. Ulterior, au fost colectate probe de lapte. Toate procedurile care implică animale au fost aprobate de comitetul israelian pentru îngrijirea și experimentarea animalelor.

Randamentul laptelui

Pentru a dezvălui efectul dietei continue LEP (3 luni) asupra potențialului de producere a laptelui de vaci de vită, am determinat producția de lapte prin tehnica de cântărire-supt-cântărire. Această tehnică este una dintre metodele cele mai frecvent citate pentru măsurarea producției de lapte și, în ciuda unor limitări, un rezultat similar poate fi determinat atunci când se utilizează în comparație cu o mașină de muls (Benson și colab. 1999). Vacile și vițeii au fost separați cu 16 ore înainte de prelevare. Diferența dintre greutatea vițelului înainte și după alăptare, ajustată la o bază de 24 de ore, a furnizat o estimare a producției zilnice de lapte a vacii. Evenimentul de alăptare a continuat aproximativ 30 de minute după introducerea vițeilor în barajele lor.

Conținut de lapte

Eșantioanele de lapte măcinate manual de vaci de carne cu restricție de 3 luni pentru calorii și proteine ​​(CAP) au fost analizate pentru conținutul de grăsimi, proteine, uree și lactoză prin metoda spectroscopică în infraroșu mediu (Milkoscan FT6000; Foss Food Technology Corp., DK; AOAC 1990). Numărul de celule somatice a fost determinat de Fossomatic 5000 FC (Foss Food Technology Corp., DK).

Compoziția de acizi grași din lapte

Prelucrarea celulelor somatice din lapte

Celulele somatice din laptele proaspăt de vacă de vacă și de vaci de lapte (150-200 ml) au fost peletizate prin centrifugare la 1.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C în prezența acidului etilendiaminetetraacetic 0,5 mM (EDTA; concentrație finală) pentru a reduce nivelurile de cazeină - emulsie grasă. Peleta celulară a fost spălată de trei ori (în cazul extracției ARN) până la cinci (în cazul extracției proteinelor celulare) de ori cu soluție salină tamponată cu fosfat rece (PBS) -EDTA (0,5 mM) pentru a elimina cazeina și globulele de grăsime. Proteinele și ARN-ul au fost extrase din celulele somatice în decurs de 30 de minute de la prelevare. Până atunci, probele erau păstrate într-o cutie răcită.

Prelevarea de sânge

Sângele a fost prelevat din vena caudală a barajelor, folosind tuburi evacuate (Greiner bio-one GmbH, Austria) care conțin EDTA ca anticoagulant. Sângele a fost centrifugat la 1.000 × g, 4 ° C, pentru a separa celulele de plasmă. Stratul tampon a fost transferat într-un nou tub Eppendorf răcit. Celulele roșii rămase au fost îndepărtate prin tampon de liză RBC (Roche, cat # 1-814-389). Leucocitele au fost apoi spălate cu PBS rece și utilizate imediat pentru extracția proteinelor.

SDS-PAGE și Western blot

Lizatele cu celule întregi au fost fierte într-un tampon de aplicare a probei conținând 2-mercaptoetanol. Proteinele au fost separate prin gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (10%) și transferate pe membrane de nitroceluloză (Schleicher & Schuell Gmbh, Dassel, Germania). Membranele au fost sondate cu anti-actină monoclonală (Sigma, cat # A1978), anti-Hsp70 (recunoscând formele constitutive și inductibile ale proteinei; Sigma H5147) și anti-Hsp90 (Stressgen, cat # SPA-830), urmate prin anticorpi secundari corespunzători. Proteinele au fost vizualizate prin chemiluminescență sporită.

Identificarea αs1-cazeinei - analiza spectrometriei de masă

Extractele de proteine ​​din celulele somatice au fost rulate pe un gel de acrilamidă 10% și colorate cu albastru Coomassie. Benzile colorate de proteine, la o masă moleculară de ~ 29 kDa, au fost tăiate din gel cu o lamă de ras curată și proteinele au fost reduse cu 10 mmol l -1 ditiotreitol și modificate cu 100 mmol l -1 iodoacetamidă în 10 mmoll·l -1 bicarbonat de amoniu. Bucățile de gel au fost tratate cu acetonitril 50% în 10 mmol l-1 bicarbonat de amoniu pentru a îndepărta pata, urmată de uscarea bucăților de gel. Bucățile de gel uscate au fost rehidratate cu acetonitril 10% în 10 mmol·l-1 bicarbonat de amoniu conținând 0,005 μg · μl -1 tripsină și apoi incubate peste noapte la 37 ° C. Peptidele rezultate au fost recuperate cu 60% acetonitril cu 0,1% trifluoroacetat. Peptidele triptice au fost rezolvate prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă pe capilare de silice condensată de 0,1 × 300 mm (J&W, Folsom, CA, SUA; 100 μm id) umplute acasă cu R2 poros (Persepective, Framingham, MA, SUA ).

Peptidele au fost eluate folosind un gradient liniar de 80 de minute de 5-95% acetonitril cu 0,1% acid acetic în apă la un debit de ± 1 μl · min -1. Lichidul din coloană a fost pulverizat cu electro într-un spectrometru de masă cu capcană de ioni (LCQ; Finnigan, San Jose, CA, SUA). Spectrometria de masă (MS) a fost efectuată în modul de ioni pozitivi folosind scanarea MS completă repetată, urmată de disocierea indusă de coliziune (CID) a ionului cel mai dominant selectat din prima scanare MS. Datele de spectrometrie de masă au fost comparate cu proteoliza și CID simulate ale proteinelor din baza de date NR-National Center for Biotechnology Information utilizând software-ul Sequest (J. Eng și J. Yates, Universitatea din Washington și Finnigan, San Jose, CA, SUA) . Terminalul amino al proteinei a fost secvențiat pe un secvențial peptidic 494A [Perkin Elmer, (Applied Biosystems), Foster City, CA, SUA] conform instrucțiunilor producătorului. Migrarea αs1-cazeinei în gel a fost verificată prin rularea unei αs1-cazeină pură ca standard (Sigma).

Izolarea ARN și RT-PCR

ARN-ul total a fost extras din celulele somatice din lapte folosind TRI REAGENT LS (MRC, Cincinnati, OH, SUA Cat. # TS-120), conform recomandărilor producătorului. Pentru a îndepărta contaminarea ADN genomic, probele au fost tratate cu DNază (Epicentrul, cat # DB0711k) conform recomandărilor producătorului. Concentrația de ARN a fost măsurată prin Nano-Drop (ND-1000), precum și calitatea acestuia. Calitatea ARN-ului total a fost estimată suplimentar prin gel de agaroză nedenaturant.

ARN-ul a fost depozitat la -80 ° C sau utilizat imediat pentru reacțiile de reacție în lanț cu transcriptază inversă polimerază (RT-PCR) folosind kitul Verso cDNA (Thermo Fisher Scientific Inc. Cat # AB1453/A). Mașina PCR T-Personal (Biometra) a fost programată după cum urmează: 42 ° C timp de 60 min pentru etapa RT urmată de 95 ° C timp de 2 minute și etapele de amplificare de 94 ° C timp de 2 minute, 60 ° C timp de 40 s și 72 ° C timp de 1:30 min. A fost preparat un amestec master și alicotat la eprubete, fiecare dintre acestea fiind amplificată timp de 30 de cicluri.

Reacțiile comparative RT-PCR din Fig. 3 au fost efectuate folosind două perechi de grunduri într-un același amestec de reacție: pentru FABP3, grundul direct TTCGTGGGTACCTGGAAG și grundul invers CGAGTGCAAACTGCAGTG au amplificat un fragment de 367 bp, în timp ce pentru Cytokeratin19, grundul direct AGATGACTTCCGCACCAAGT și primerul invers G bp fragment. Pentru CD45, exemplul direct a fost ATGTATCTGTGGCTTAAAC, în timp ce exemplul invers a fost CATTACACT TGAATTGTCC. Cu excepția temperaturii de recoacere care a fost de 49 ° C, programul PCR pentru amplificarea CD45 a fost identic cu cel menționat mai sus.