• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Record ORCID pentru Julie A. Christianson
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

1. Introducere

Stresul este descris ca o modificare a homeostaziei cauzată de diverși factori fiziologici, psihologici sau de mediu [1]. Deși stresul acut este necesar pentru supraviețuire, stresul pe termen lung, în special în copilărie, poate duce la dezvoltarea tulburărilor cronice de sănătate, inclusiv a obezității [2-5]. Deși mecanismul care stă la baza acestei asocieri nu a fost pe deplin stabilit, a fost implicată neregularizarea axei hipotalamo-hipofizo-suprarenale (HPA). Axa HPA este un sistem neuroendocrin care contribuie la reglarea răspunsului la stres [6]. În timpul unui eveniment stresant, hipotalamusul eliberează factorul de eliberare a corticotropinei (CRF), care semnalează glanda pituitară să elibereze hormonul adrenocorticotrofic (ACTH). ACTH semnalează apoi cortexul suprarenal pentru a elibera glucocorticoizi, care includ cortizol la om și corticosteron la rozătoare [7]. La eliberare, glucocorticoizii modulează multe efecte metabolice din aval, inclusiv modificări ale metabolismului glucozei și grăsimilor, precum și controlul sistemului cardiovascular și al răspunsului imun [8]. CRF poate funcționa și în periferie prin activarea mastocitelor (MC), care eliberează citokine și proteaze care contribuie la formarea unui mediu pro-inflamator [9, 10].

reduce

Axa HPA nu este pe deplin dezvoltată atunci când copiii se nasc și, prin urmare, evenimentele stresante din această etapă pot provoca daune permanente pe termen lung reglementării și producției acestui sistem, contribuind la rezultate slabe asupra sănătății la vârsta adultă [11]. Neglijarea copilului și maltratarea sunt două forme de stres timpuriu care sunt asociate cu dezvoltarea obezității la vârsta adultă la om [3-5]. În plus, hiperactivitatea axei HPA este observată la pacienții cu obezitate viscerală [12, 13]. Cercetările efectuate pe primate neumane [14] și rozătoare [15] arată, de asemenea, modificări ale funcțiilor metabolice induse de stres în viața timpurie.

În plus față de stres, alți factori de risc de mediu asociați cu dezvoltarea obezității includ un stil de viață sedentar și consumul unei „diete occidentale” (proporție mare de grăsimi saturate și zaharuri rafinate) [16-21]. Această asociație este deosebit de îngrijorătoare, deoarece comportamentul sedentar este foarte răspândit în Statele Unite, unde majoritatea indivizilor nu îndeplinesc cerințele recomandate pentru activitatea fizică zilnică [22], iar consumul de dietă occidentală a crescut datorită comodității și costului redus [23]. Obezitatea viscerală sau centrală este o componentă a sindromului metabolic (MetS) [24], care este diagnosticată atunci când un individ îndeplinește 3 dintre următoarele 5 criterii: obezitate centrală, rezistență la insulină, hipertensiune arterială, trigliceride ridicate și colesterol lipoproteic cu densitate ridicată [25]. Există o incidență ridicată a MetS în Statele Unite, unde 33% dintre adulți îndeplinesc criteriile de diagnostic [26]. Constelația factorilor de risc asociați cu MetS se sinergizează pentru a crește atât pentru diabetul de tip 2, cât și pentru bolile cardiovasculare.

Este clar că obezitatea și dezvoltarea ulterioară a MetS sunt probleme substanțiale de sănătate publică. Prin urmare, studierea factorilor de risc pentru dezvoltarea acestor afecțiuni cronice, precum și cea mai eficientă modalitate de a le trata este extrem de importantă. În studiul de față, folosim un model de stres timpuriu la șoareci, separarea maternă neonatală (NMS), care afișează dovezi ale modificării reglării axei HPA [27, 28] pentru a testa ipoteza că expunerea la stres timpuriu a vieții crește susceptibilitatea la consecințele metabolice dăunătoare ale combinării unui stil de viață sedentar și a unei diete occidentale pe termen lung. În plus, deoarece modificările stilului de viață, cum ar fi exercițiile fizice și dieta, s-au dovedit a îmbunătăți simptomele MetS atât la oameni [21, 29, 30], cât și la rozătoare [31], am studiat dacă exercițiul, sub forma rulării voluntare a roților, ar putea fi utilizat ca o intervenție terapeutică în prevenirea MetS legate de obezitate. Din câte știm, acesta este primul studiu care combină stresul timpuriu, dieta și exercițiile fizice pentru a studia dezvoltarea factorilor legați de MetS la șoareci.

2. Metode

2.1 Animale

Toate experimentele din acest studiu au fost efectuate pe șoareci masculi C57Bl/6 (Charles River, Wilmington, MA) născuți și găzduiți în Centrul de asistență pentru cercetare de la Universitatea din Kansas Medical Center. Șoarecii au fost adăpostiți pe un ciclu de lumină de 12 ore (600 la 1800 de ore) și au primit apă și alimente ad libitum. Toate cercetările au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Centrul Medical al Universității din Kansas (numărul de protocol 2016-2344), în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator.

2.2 Proiectare experimentală

Proiectul nostru experimental este schematizat în Figura 1. Pe scurt, șoarecii au suferit NMS sau au rămas neatinse în primele trei săptămâni de viață. Rularea voluntară a roții a fost introdusă la vârsta de 4 săptămâni, coincizând cu o dietă de control. La vârsta de 16 săptămâni, jumătate dintre șoarecii sedentari și exercitați au fost supuși unei diete HFS până la vârsta de 27 de săptămâni.

Șoarecii au fost supuși NMS de la P1 la P21 sau au rămas fără manipulare (naivi) și au fost înțărcați și adăugați în perechi cu colegii de gunoi pe P22. Jumătate din cuști erau echipate cu o roată de rulare la vârsta de 4 săptămâni. Toți șoarecii au fost, de asemenea, plasați pe o dietă de control la vârsta de 4 săptămâni. La vârsta de 16 săptămâni, dieta de control a fost înlocuită cu o dietă HFS în jumătate din toate cuștile. Creșterea în greutate, distanța parcursă și dieta consumată au fost măsurate săptămânal. Analiza compoziției corpului a avut loc la vârsta de 14 și 27 de săptămâni. S-au luat măsurători ale punctului final, inclusiv insulină și glucoză în repaus alimentar, toleranță la glucoză și analize adipoase la vârsta de 27 de săptămâni.

2.3 Separarea maternă neonatală

Barajele gravide C57Bl/6C au fost livrate la unitatea animală între 14-16 zile de gestație. Începând din ziua 1 postnatală (P1) până la P21, așternuturile NMS au fost îndepărtate în masă și așezate într-un pahar de sticlă curat cu așternut din cușca lor de acasă timp de 180 de minute (11:00 - 14:00) zilnic. Paharul a fost plasat într-un incubator menținut la 33 ° C și 50% umiditate. Șoarecii naivi au rămas netulbiți în cușca lor de acasă, cu excepția creșterii normale a animalelor. Toți șoarecii au fost înțărcați pe P22 și au fost adăpostiți cu perechi de așternut de același sex. La vârsta de 4 săptămâni, toți șoarecii au fost puși pe o dietă de control constând din 20% kcal proteine, 70% kcal carbohidrați (3,5% zaharoză), 10% kcal grăsimi (3,85 kcal/g; Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ; cat. D12110704).

2.4 Exercițiu

La vârsta de 4 săptămâni, jumătate dintre șoarecii naivi și NMS au fost împărțiți în grupuri voluntare de rulare exercitate (Ex) sau sedentare (Sed). Șoarecii ex-au fost adăpostiți în perechi cu o pereche de gunoi în cuști echipate cu o roată de rulare din oțel inoxidabil (STARR Life Sciences Corp, Oakmont, PA), iar șoarecii Sed au fost adăpostiți în perechi fără acces la o roată de rulare. Distanța alergată/perechea a fost înregistrată de STARR Life Sciences VitalView Activity Software versiunea 1.1. A fost implementată o pereche de carcase pentru a elimina stresul potențial asociat cu carcasa unică a rozătoarelor.

2.5 Dieta bogată în grăsimi/bogată în zaharoză (HFS)

La vârsta de 16 săptămâni, jumătate din grupurile naive și NMS-Sed și -Ex au fost plasate pe o dietă HFS constând din 20% kcal proteine, 35% kcal carbohidrați (15% zaharoză) și 45% kcal grăsimi (4,73 kcal/g; Research Diets), pentru a imita o dietă în stil occidental.

2.6 Consumul de alimente și eficiența furajelor

Consumul de alimente pe pereche de șoareci a fost măsurat săptămânal. Eficiența hranei pentru animale a fost cuantificată în fiecare săptămână folosind următoarea ecuație: (schimbarea greutății per pereche)/(calorii consumate per pereche)) * 1000. Este prezentat ca eficiența medie a hranei pe parcursul celor 11 săptămâni ale experimentului după începerea dietei HFS.

2.7 Analiza compoziției corpului

Șoarecii au fost cântăriți și compoziția corpului a fost măsurată prin qMRI folosind EchoMRI 1100 (EchoMRI LLC, Houston, TX). Greutatea totală, procentul de grăsime corporală și masa de grăsime liberă au fost cuantificate la fiecare 2-3 săptămâni. N = 4 pentru toate grupurile, cu excepția Ex-HFS, n = 6.

2.8 Testul de toleranță la glucoză

La vârsta de 27 de săptămâni, după un post de 6 ore, șoarecilor li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză la 1 g/kg greutate corporală. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate prin clemă de coadă imediat înainte de injecția de glucoză și după 15, 30, 60 și 120 de minute după aceea, folosind un test colorimetric (prepararea enzimei PGO și diclorhidrat de dianisidină, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Măsurările suprafeței sub curbă au fost calculate utilizând metoda trapezoidală [32].

2.9 Nivelul insulinei în repaus alimentar

Colecția inițială de sânge în repaus alimentar descrisă mai sus a fost, de asemenea, utilizată pentru a măsura nivelurile serice de insulină utilizând un kit ELISA pentru insulină conform instrucțiunilor producătorului (ALPCO, Salem, NH).

2.10 extracție ARNm și RT-PCR

Șoarecii au fost supradozați cu izofluran inhalat. Țesutul adipos epididimal a fost disecat, înghețat imediat în azot lichid și depozitat la -80 ° C. Țesutul înghețat a fost apoi zdrobit (Cellcrusher, Portland, OR) și ARN-ul total a fost izolat folosind QIAzol Lysis Reagent și RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Concentrația și puritatea au fost determinate utilizând NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) și ADNc a fost sintetizat din ARN-ul total folosind kitul de sinteză iScript cDNA (Bio-Rad, Hercules, CA). RT-PCR cantitativ a fost efectuat folosind SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad) și un sistem de PCR în timp real Bio-Rad iCycler IQ cu primeri indicați 20uM (Tabelul 2; Tehnologii ADN integrate, Coralville, IA). Probele au fost efectuate în triplicat și reacțiile de control negativ au fost efectuate cu fiecare serie de amplificare. Pentru a reduce variabilitatea dintre eficiență datorită fluctuațiilor fluorescenței de bază, datele brute PCR au fost importate în software-ul LinRegPCR și valorile de eficiență PCR au fost derivate pentru fiecare probă individuală. Valorile ciclului prag au fost scăzute din cea a genei de menaj PPiB și modificarea de ori asupra naïve-Sed-Control a fost calculată folosind metoda Pfaffl [33].

2.11 Analiza statistică

Datele sunt raportate ca media ± SEM. Calculele măsurătorilor de mai sus au fost făcute în Excel (Microsoft, Redmond, WA), iar analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism 8 (GraphPad, La Jolla, CA) sau IBM SPSS Statistics 24 (IBM Corporation, Armonk, NY). Diferențele dintre grupuri au fost determinate de ANOVA cu 2 sau 3 căi sau ANOVA RM cu 4 căi și post-test LSD sau Bonferroni al lui Fisher. Semnificația statistică a fost stabilită la p 0,05).