Sofia Lopes

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

André Lopes

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Vitor Pinto

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Marco R. Guimarães

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Vanessa Morais Sardinha

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Sara Duarte-Silva

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Sara Pinheiro

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

João Pizarro

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

João Filipe Oliveira

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Nuno Sousa

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Hugo Leite - Almeida

1 Institutul de Cercetări în Științe ale Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

Ioannis Sotiropoulos

1 Institutul de Cercetări în Științele Vieții și Sănătății (ICVS), Școala de Științe ale Sănătății, Universitatea din Minho, Campus Gualtar, 4710-057, Braga, Portugalia

2 ICVS/3B's - Laborator asociat guvernamental PT, Braga/Guimarães, Portugalia

rezumat

Introducere

Prezentarea clinică a bolii Alzheimer (AD) este complexă și se extinde dincolo de deficiențele cognitive care caracterizează această tulburare (Duker și colab., 2012). Modificări ale expresiei faciale, mersului și posturii, precum și manifestări de rigiditate, bradichinezie și tremur sunt găsite în stadii tardive ale AD, deși dovezile crescânde sugerează că problemele motorii apar cu mult înainte de orice semn recunoscut al AD (Wilson și colab., 2000; Scarmeas și colab. ., 2004; Buchman și Bennett, 2011). Hiperfosforilarea anormală a Tau și disfuncționalitatea ulterioară sunt postulate ca mecanisme cruciale în disfuncția neuronală AD, unde formele hiperfosforilate și/sau agregate (insolubile) de Tau prezintă acțiuni neurodegenerative care, de asemenea, interferează cu Tau normal, sechestrând și reducând formele Tau solubile (Ksiezak - Reding și colab., 1988; Zhukareva și colab., 2003). Aceste leziuni se găsesc în principal în diferite zone ale SNC, cum ar fi hipocampul și cortexul, deși unele studii demonstrează, de asemenea, prezența deficitelor de Tau în sistemul nervos periferic (SNP; de exemplu, ganglionii autonomi și nervii sciatici Bohl și colab., 1997; Holzer și colab., 1999). În timp ce dovezile sugerează că reducerea Tau poate bloca progresia patologiei AD (Roberson și colab., 2007), indicând faptul că strategiile orientate către Tau ar putea fi de interes pentru terapia AD (Gotz și colab., 2012), siguranța și/sau potențialul efect secundar (s) dintre aceste abordări nu sunt bine studiate.

Ștergerea genetică Tau pare a fi bine tolerată de animalele tinere, deoarece majoritatea modelelor Tau -/- nu prezintă modificări ale comportamentului sau ale microtubulilor (Dawson și colab., 2001; revizuit de Ke și colab., 2012). Cu toate acestea, pierderea cronică a Tau a fost descrisă ca rezultând deficite motorii subtile sau ușoare la animalele din ce în ce mai în vârstă (revizuite de Gotz și colab., 2013). Într-adevăr, un studiu a relevat pierderea neuronilor dopaminergici substantia nigra (SN) la animale Tau -/- de vârstă mijlocie (Lei și colab., 2012), în timp ce într-un alt studiu, folosind Tau -/- în vârstă de aceeași tulpină, motor similar s-au arătat deficite, dar într-o manieră independentă de SN-/dopamină (Morris și colab., 2013), crescând incertitudinea cu privire la mecanismele subiacente ale deficitelor motorii la animalele Tau -/-. În mod surprinzător, implicarea PNS nu a fost evaluată în niciunul dintre studiile anterioare, dat fiind faptul că reducerea Tau se găsește în nervii periferici (de exemplu, nervul sciatic) la pacienții cu AD (Holzer și colab., 1999). Prin urmare, acest studiu a urmărit să monitorizeze impactul pierderii cronice de proteină Tau în eferențele PNS, compartimentul primar al circuitelor motorului și performanța motorului utilizând o baterie de teste comportamentale care analizează funcția motorului atât la tineri (4-6 luni), cât și la vârstnici (17- 22 luni) Șoareci Tau -/- combinați cu o analiză morfofuncțională sistematică a nervului lor sciatic.

Rezultate

Lipsa cronică de Tau are ca rezultat deficite motorii la animalele bătrâne

declanșează

Mecanismele care stau la baza comportamentului motor afectat în absența Tau la persoanele în vârstă nu sunt pe deplin înțelese, fiind raportate constatări contradictorii. Lei și colab. (2012), de exemplu, au raportat o pierdere legată de vârstă a neuronilor dopaminergici SN la animale Tau -/- de vârstă mijlocie. În contrast, un studiu recent pe aceeași linie Tau -/- nu a reușit să observe nicio pierdere dopaminergică majoră în diferite componente motorii ale SNC ale șoarecilor vechi Tau -/- (Morris și colab., 2013). În timp ce ambele studii au arătat deficite motorii, Lei și colab. (2012) au arătat pierderea nigrostriatală la șoarecii Tau -/- de vârstă mijlocie de fond C57BL/6/SV129, în timp ce studiul nostru și studiul lui Morris și colab. (2013) nu au găsit pierderi neuronale nigrostriatale la șoareci vechi cu fundal C57BL/6 (datele nu sunt prezentate). Mai mult, într-un studiu ulterior, Lei și colab. (2014) au arătat că deficiențele motorii ale animalelor Tau -/- vechi nu depind de fond sau au un profil dependent de sex. În conformitate cu aceasta, în ciuda faptului că studiul nostru a folosit animale masculine, iar studiul Morris (2013) a folosit o cohortă mixtă (masculină și feminină), ambele studii prezintă deficite motorii care oferă un sprijin suplimentar fără influență de gen în vechiul Tau -/- deficite motorii.

În timp ce o serie de zone ale SNC au fost implicate în apariția deficitelor motorii asociate cu AD, s-a acordat puțină atenție eferențelor primare ale SNP. Dovezile anterioare sugerează că nervii sciatici ai pacienților cu AD, dar nu și ai persoanelor sănătoase potrivite pentru vârstă, prezintă niveluri reduse de Tau (Holzer și colab., 1999). În studiul nostru, am demonstrat că pierderea cronică a proteinei Tau are ca rezultat deficite morfofuncționale ale nervului sciatic, care include un procent crescut de fibre degenerante, hipomielinizarea fibrelor cu diametru mare, motor, și proprietăți de conducere diminuate la bătrâni, dar nu tineri, Tau-/- nervul sciatic. În timp ce alte mecanisme nu pot fi excluse, deficitele de nerv sciatic menționate anterior pot contribui în mod critic la deficiențele motorii găsite în vechiul Tau -/- deoarece reglarea fină a grosimii și formării învelișului de mielină este importantă pentru întreținerea și funcționarea corectă a fibrelor motorii. În plus, deși nu s-au găsit diferențe de amplitudine în potențialele de acțiune musculară ale Tau -/-, au fost necesare studii suplimentare pentru a clarifica impactul pierderii Tau asupra joncțiunii neuromusculare prin îmbătrânire, deoarece s-a dovedit că patologia legată de Tau în neuronii motori are neuromusculare defecțiuni ale joncțiunilor și deficite ale motorului la modelele AD Tg (Zhang și colab., 2005; Ubhi și colab., 2007).

Proceduri experimentale

Animale

În acest studiu, s-au utilizat bărbați Tau +/+ și Tau -/- bărbați cu vârsta cuprinsă între 4 și 6 - și 17 - până la 22 (Dawson și colab. (2001); C57BL/6 fundal). Șoarecii au fost găzduiți 4-5 animale pe cușcă în condiții de mediu standard cu acces ad libitum la alimente și apă. Toate procedurile experimentale au fost aprobate de comitetul etic local și de autoritatea națională pentru experimentarea animalelor și au fost în conformitate cu liniile directoare pentru îngrijirea și manipularea animalelor de laborator, așa cum sunt descrise în Directiva 2010/63/UE.

Teste comportamentale

Analiza ultrastructurii nervului sciatic

Sub anestezie profundă [clorhidrat de ketamină (75 mg kg -1) și medetomidină (1 mg kg -1)], nervii sciatici au fost colectați și fixați imediat în glutaraldehidă 4% (în tampon de cacodilat de sodiu 0,1 m, pH 7,4) timp de 7 zile și temperatura camerei și apoi postfixat în 1% OsO4, deshidratat. În cele din urmă, țesutul a fost încorporat în rășină epon (Electron Microscopy Sciences) și secționat în conformitate cu obiectivul (vezi mai jos). Secțiunile transversale de un micrometru care acoperă aria nervoasă a secțiunii transversale complete au fost colorate cu 1% p - fenilen diamină și montate pe Entellan (Merk). Imaginile microscopului cu lumină (Olympus DP70, Hamburg, Germania) au fost apoi montate pe Photoshop și utilizate pentru calculul manual al numărului și densității fibrelor mielinizate pe secțiune transversală (4-5 animale pe grup). Pentru evaluarea fibrelor degenerante, au fost utilizate 16 fotografii TEM care nu se suprapun (3000 ×) ale secțiunilor ultra subțiri contracolorate (60 nm) (obținute prin JEM - 1400 TEM). Aceleași imagini TEM au fost utilizate și pentru calcularea raportului g [diametru axon/(diametru axon + grosime mielină)]; mai mult de o sută de fibre au fost măsurate pe animal. Analiza morfometrică a fost efectuată de un orb experimental la proveniența probelor.

Măsurarea ex vivo a potențialelor de acțiune compuse

Nervii sciatici izolați acut din fiecare grup (6-8 animale pe grup) au fost folosiți pentru evaluarea vitezei de conducere a fibrelor A- și C - și a potențialilor de acțiune compuși așa cum s-a descris anterior (Pinto și colab., 2008). Pe scurt, nervii sciatici au fost disecați și curățați de învelișul țesutului conjunctiv în lichidul cefalorahidian artificial. Înregistrările potențiale de acțiune compuse au fost realizate cu un amplificator Multiclamp 700B în modul CC și digitalizate cu digitizatorul Digidata 1440a utilizând software-ul PCLAMP 10 (Axon Instruments, Sunnyvale, CA, SUA). Semnalele au fost filtrate cu trecere scăzută la o frecvență efectivă de colț de 16 KHz și eșantionate la 50 KHz. Fibrele au fost stimulate la 60 μs, iar vitezele de conducere au fost calculate pentru primul potențial de acțiune compus de vârf; suprafețele totale au fost calculate utilizând software-ul CLAMPFIT (Axon Instruments). Înregistrările și analizele electrofiziologice au fost efectuate de un experimentator orb de proveniența țesutului.

Măsurători electrofiziologice in vivo

Analiza Western blot

Nervii sciatici Tau -/- și Tau +/+ au fost omogenizați [10 mm HEPES pH 7,9, 150 mm NaCI, 1 mm EGTA, 1 mm EDTA, 10% glicerol, 1% NP - 40, Inhibitor complet de protează (Roche, Mannheim, Germania) și Cocktailurile cu inhibitori de fosfatază II și III (Sigma, St Louis, MO, SUA)]. După sonicare și centrifugare (15.000 g; 10 min; 4 ° C), conținutul de proteine ​​a fost estimat prin testul Bradford și lizatele au fost electroforizate pe geluri de acrilamidă 10% și transferate pe membrane de nitroceluloză (BIORAD Turbo, München, Germania). Pentru detectarea nivelurilor de MBP, membranele au fost blocate în soluție salină tamponată Tris conținând 5% lapte degresat în TBS-T înainte de incubare cu anticorpi împotriva MBP (Serotec, Oxford, Marea Britanie; 1: 500), Tau (abcam, Cambridge, Marea Britanie; 1: 1000) și actină (DSHB, Universitatea din Iowa, IA, SUA; 1: 2000). Antigenele au fost relevate prin chemiluminiscență sporită (BIORAD) după incubare cu conjugate corespunzătoare peroxidază de hrean - imunoglobulină G (BIORAD). Bloturile au fost scanate și cuantificate utilizând software-ul de bioimaginare tina 3.0 (Raytest, Straubenhardt, Germania). Toate valorile au fost normalizate față de actină.

analize statistice

Cu excepția cazului în care se specifică altfel, a fost utilizat ANOVA bidirecțional având genotip (Tau +/+ vs. Tau -/-) și îmbătrânire (adult vs. vechi) ca factori și urmat de analiza post-hoc Tukey (SPSS, Aspire Software, Armonk, NY, SUA). Diferențele au fost considerate semnificative dacă p Bohl J, Ulbricht D, Steinmetz H (1997) Încurcături neurofibrilare în celulele ganglionare autonome periferice În boala Alzheimer: Biologie, diagnostic și terapie (Iqbal K, Winblad B, Nishimura T, Takeda M, Wisniewski H, eds). Chichester: John Wiley & Sons, pp. 281–287. [Google Scholar]