Abstract

fundal

Prevalența obezității a crescut dramatic la nivel mondial și a atras atenția tot mai mare, dar mecanismul este încă neclar. Studiile anterioare au dezvăluit că canalele vaniloide 1 (TRPV1) potențiale ale receptorului tranzitoriu participă la pierderea în greutate prin îmbunătățirea nivelurilor intracelulare de Ca 2+. Cu toate acestea, mecanismul potențial al efectului capsaicinei dietetice asupra obezității nu este pe deplin înțeles. Transferul de Ca 2+ indus de moleculele conexin43 (Cx43) între celulele cuplate participă la diferențierea adipocitelor. Nu se cunoaște dacă modificările evocate de TRPV1 în comunicarea adipocită-adipocită mediate de Cx43 joacă un rol în obezitate.

Materiale și metode

Am investigat dacă Cx43 a participat la lipoliza adipocitelor mediată de TRPV1 în preadipocite 3T3-L1 cultivate și în țesuturile adipoase viscerale de la om și șoareci de tip sălbatic (WT) și deficienți de TRPV1 (TRPV1 -/-).

Rezultate

TRPV1 și Cx43 co-exprimate în țesutul adipos mezenteric. Activarea TRPV1 de către capsaicină a crescut afluxul de Ca 2+ în preadipocite 3T3-L1 și a favorizat lipoliza celulară, așa cum se arată prin colorarea cu roșu ulei. Aceste efecte au fost deficiente atunci când s-a administrat capsazepină, un antagonist al TRPV1, și acid 18 alfa-gliciretinic (18α-GA), un inhibitor al joncțiunii gap. Capsaicina dietetică cronică pe termen lung a redus greutățile țesuturilor perirenale, mezenterice și adipoase testiculare la șoarecii WT hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Capsaicina a crescut nivelurile de expresie ale p-CaM, Cx43, CaMKII, PPARδ și HSL în țesuturile adipoase mezenterice de la șoareci WT hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, șoareci db/db, precum și la oameni obezi, dar aceste efecte ale capsaicinei au fost absente în TRPV1 -/- șoareci. Capsaicina dietetică cronică pe termen lung a scăzut greutatea corporală și lipidele serice ale șoarecilor WT, dar nu și șoarecii TRPV1 -/-, hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.

Concluzie

Acest studiu a demonstrat că activarea cu capsaicină a TRPV1 evocată a crescut influxul de Ca 2+ în comunicarea adipocită-adipocită mediată de Cx43 promovează lipoliza atât in vitro, cât și in vivo. Activarea TRPV1 de către capsaicina alimentară îmbunătățește remodelarea grăsimilor viscerale prin reglarea în sus a Cx43.

fundal

Materiale și metode

Tratamentul animalelor și proceduri experimentale

Caracteristici ale subiecților

Am recrutat subiecți bărbați obezi și aceștia au fost clasificați dacă circumferința taliei era mai mare de 90 cm în conformitate cu criteriile asiatice ale Biroului regional al OMS pentru Pacificul de Vest/Asociația Internațională pentru Studiul Obezității/Grupul Internațional de Obezitate. S-au obținut vârsta, indicele de masă corporală, circumferința taliei. Țesuturile grase viscerale au fost obținute de la pacienți în timpul colecistectomiei programate regulat. Colecistectomia trebuia efectuată din cauza calculilor biliari simptomatici. Protocolul a fost aprobat de Comitetul de Etică local. Toți subiecții au dat consimțământul scris în scris.

Examen histopatologic

Țesutul adipos a fost curățat cu soluție salină și ponderat. Grăsimile viscerale de la șoareci WT și umani au fost observate cu tehnici de felie de îngheț și colorate cu anticorpi anti-TRPV1 sau Cx43 [20]. TRPV1 și Cx43 în preadipocite 3T3-L1 izolate sau adipocite cultivate primar din țesut adipos visceral au fost identificate prin colorare imunofluorescentă. Preadipocitele 3T3-L1 au fost cultivate, fixate și colorate cu colorant lipofil roșu ulei O (Sigma-Aldrich). Colorarea roșie a arătat picături de lipide în citoplasmă, indicând numărul de picături de lipide în preadipocite 3T3-L1 conform tehnicilor stabilite [26].

Test de cultură celulară și diferențiere a adipocitelor

Măsurarea intracelulară a calciului liber

Celulele 3T3-L1 crescute pe suport de sticlă au fost încărcate cu indicatorul Ca 2+ Fura-2 (2 μmol/L, Invitrogen, Paisley, Marea Britanie) și 0,025% Pluronic F-127 într-o soluție salină fiziologică timp de 40 min la temperatura camerei în întunericul. [Ca 2+] eu a fost măsurată folosind un cititor de plăci fluorescente (Varioskan Flash, Thermo) la emisie de 510 nm, cu lungimi de undă de excitație de 340 nm și 380 nm. Modificările din [Ca 2+] eu au fost calculate din rapoartele creșterilor tranzitorii ale intensității fluorescenței la 340 nm și 380 nm [8].

Recuperarea fluorescenței după albirea foto (FRAP)

Analiza imunoblotării

Imunoblotarea TRPV1, Cx43, p-CaM, CaMKII, PPARδ, HSL, β-actină și GAPDH au fost efectuate folosind tehnici standard pentru țesutul adipos și celulele adipoase mature. Anticorpul primar pentru TRPV1 a fost achiziționat de la Alomone, Israel și alți anticorpi primari au fost de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, SUA). După incubarea cu anticorpii secundari timp de 1 oră, proteinele au fost detectate prin chemiluminescență sporită și cuantificate folosind un Gel Doc 2000 Imager (Bio-Rad).

Măsurarea trigliceridelor și a acidului gras liber din celule

Lipidele totale au fost extrase din preadipocite 3T3-L1 folosind un amestec de cloroform-metanol (2: 1, vol/vol). Nivelurile de trigliceride și acizi grași liberi au fost cuantificate folosind kitul ELISA (Applygen Technologies Inc., China) conform instrucțiunilor producătorului. Extractele celulare au fost colectate și centrifugate la viteza de 10000 rpm timp de 15 minute pentru a obține supernatantul. Apoi, 100 pl de supernatant și 50 pl de enzimă conjugată au fost adăugați la placa furnizată cu 96 de godeuri timp de 1 oră la 37 ° C, în timp ce curba standard a fost realizată în aceeași placă. După aceea, fiecare godeu a fost spălat cu soluția de spălare diluată de 5 ori, uscat bine cu hârtie absorbantă. Apoi s-au adăugat cu succes 50 pl de substrat A și 50 pl de substrat B și placa a fost incubată la 37 ° C timp de 15 min. În cele din urmă, soluția de stop 50 μl a fost apoi adăugată la fiecare godeu și valorile OD450 au fost măsurate cu Varioskan Flash, Thermo.

analize statistice

Datele au fost exprimate ca media ± SEM de la trei la 3-15 experimente independente sau șoareci. Comparațiile între grupuri au fost analizate folosind Student’s t test sau ANOVA unidirecțional cu testul post hoc de comparație multiplă a lui Bonferroni (GraphPad Prism; La Jolla, CA, SUA). Cu două cozi p valori mai mici de 0,05 au fost considerate pentru a indica semnificația statistică.

Rezultate

TRPV1 funcțional coexprimat cu Cx43 în țesuturile adipoase mezenterice și preadipocite 3T3-L1

canalului

Inhibarea Cx43 reduce creșterea citosolică a calciului indusă de activarea TRPV1 și previne adipoliza în 3 preadipocite T3 - L1

TRPV1 promovează lipoliza preadipocitelor 3T3-L1 prin reglarea nivelurilor de calciu intracelular mediate de Cx43

Recuperarea fluorescenței după albire foto este utilizată pentru a măsura dinamica mobilității Cx43. Am folosit metoda gap-FRAP pentru a studia efectul TRPV1 asupra Cx43 în preadipocite 3T3-L1. Rezultatele au arătat că inhibarea atât a TRPV1, cât și a Cx43 au indus puține modificări în exterior și o recuperare redusă a fluorescenței în regiunile decolorate în preadipocitele 3T3-L1 tratate atât cu Capsazepină, cât și cu 18α-GA, ceea ce a afectat dinamica mobilității Cx43 (Figura 3A și B ). Preadipocitele 3T3-L1 au fost tratate cu acizi grași liberi (FFA), FFA + capsaicină (Cap), FFA + capsaicină plus antagonist TRPV1 capsazepină (Capz), FFA + capsaicină + etilenglicol-bis (beta-aminoetileter) -N, N ' -acid tetraacetic (EGTA, chelator de calciu), FFA + capsaicină + 18α-GA (18α-GA, 150 μmol/L) sau FFA + capsaicină plus inhibitor PPARδ GSK0660 (10 μmol/L) timp de 24 de ore. Intervenția medicamentoasă a arătat că activarea TRPV1 de către capsaicină a dus la reglarea în sus a Cx43, CaMKII, PPARδ și HSL. Inhibarea TRPV1 sau Cx43 de către capsazepină sau 18α-GA și expunerea la EGTA au mediat reglarea descendentă a Cx43, CaMKII, PPARδ și HSL în preadipocite 3T3-L1 (Figura 3C). Aceste rezultate au indicat faptul că activarea TRPV1 de către capsaicină a crescut calciul intracelular asociat cu funcția Cx43 și a favorizat lipoliza în preadipocitele 3T3-L1.

Activarea TRPV1 de către capsaicină crește lipoliza mediată de Cx43 a țesutului adipos visceral la om și șoareci

Activarea TRPV1 de către capsaicina alimentară îmbunătățește obezitatea bogată în grăsimi și metabolismul lipidelor

Greutatea corporală a șoarecilor WT și TRPV1 -/- hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HD) au fost semnificativ mai mari decât cele ale șoarecilor din grupul ND după o intervenție de 2 luni. Deoarece activarea cronică a TRPV1 de către capsaicina alimentară a favorizat lipoliza grăsimii viscerale, am căutat să stabilim dacă activarea TRPV1 de către capsaicină a redus greutatea corporală, aportul de alimente, TG seric, colesterolul total (TC), colesterolul lipoproteinelor cu densitate scăzută (LDL-C) și colesterolul lipoproteic de înaltă densitate (HDL-C). Am constatat că capsaicina dietetică cronică a redus semnificativ greutatea corporală a șoarecilor WT hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi după 5 luni, dar că efectul a fost absent la șoarecii TRPV1 -/- (Figura 5A și B). Aportul de alimente nu a avut nicio diferență între fiecare grup atât la șoareci WT, cât și la TRPV1 -/-. Capsaicina dietetică a scăzut, de asemenea, nivelul lipidelor serice la șoarecii WT hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (Tabelul 1). Astfel, capsaicina dietetică pe termen lung reduce greutatea corporală și nivelurile serice de lipide la șoarecii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.

Discuţie

În acest studiu, am constatat că TRPV1 funcțional co-exprimat cu Cx43 atât în ​​țesutul adipos visceral, cât și în preadipocite 3T3-L1. Activarea TRPV1 de către capsaicină a crescut nivelul de calciu intracelular, a afectat funcția Cx43 și a promovat în continuare lipoliza în preadipocitele 3T3-L1. Capsaicina cronică pe termen lung a crescut expresia p-CaM, Cx43, CaMKII, PPARδ și HSL în țesuturile adipoase viscerale de la șoareci WT și db/db și oameni obezi. Aceste rezultate sugerează că capsaicina dietetică pe termen lung promovează remodelarea viscerală a grăsimilor și previne obezitatea indusă de dietă bogată în grăsimi la șoareci prin creșterea influxului de Ca 2+ prin canalele TRPV1 mediate de Cx43.

Mai mult, o dietă bogată în calciu poate reduce acumularea de lipide și poate promova lipoliza și pierderea în greutate [39]. În stadiile incipiente ale diferențierii adipocitelor, creșterea nivelului intracelular de calciu liber poate preveni diferențierea și maturarea adipocitelor [40]. Ca 2+ intracelular este una dintre moleculele de semnalizare importante ale adipogenezei. Studiile noastre anterioare au arătat că activarea TRPV1 de către capsaicina dietetică previne obezitatea prin inhibarea diferențierii și maturării adipocitelor cu o creștere a inducerii influxului de Ca 2+ [20]. Prin urmare, calciul liber intracelular reglează metabolismul lipidelor și este legat de diferențierea adipocitelor.

Unele molecule joacă roluri în metabolismul lipidic prin canalele de calciu. Connexina este un canal direct prezent în mod regulat între celule care reglează transducția semnalului, ioni, aminoacizi, nucleotide, al doilea mesager și alți factori metabolici; permite trecerea moleculelor cu greutăți moleculare mai mici de 1000 Da [41]. Calmodulina (CaM), o proteină citosolică de legare a Ca 2+, este o proteină acidă cu un singur lanț cu o greutate de 16700 Da. CaM are patru regiuni cu structuri similare care pot fi combinate cu ioni de calciu pe moleculă. Când concentrația intracelulară de calciu crește tranzitoriu la 10

De 100 de ori concentrația de calciu extracelular, CaM este activat după legarea de ioni de calciu și apoi se combină cu enzime. Concentrația intracelulară de calciu, reglată de ioni de calciu, este importantă pentru reacțiile biochimice. CaM se propune să joace un rol în decuplarea indusă de Ca 2+ a joncțiunilor gap, deoarece s-a demonstrat că inhibitorii CaM împiedică acest răspuns [42]. Siturile de legare CaM au fost identificate recent în buclele citoplasmatice a cel puțin trei conexine α-subfamiliale (Cx43, Cx44 și Cx50).

Joncțiunile gap Cx43 sunt închise de un mecanism dependent de Ca 2+/CaM care implică sfertul carboxil-terminal al domeniului buclei citoplasmatice conexinei [43]. Reziduurile de aminoacizi din capătul Cx43- carboxil sunt ținte ale protein kinazelor multifuncționale, cum ar fi Ca 2+/CaM protein kinaza II (CaMKII), o enzimă cunoscută pentru a juca roluri critice în homeostazia, transcripția, apoptoza și inima ischemică Ca 2+ boală. Activitatea CaMKII este importantă pentru reglarea Cx43 în țesuturile normale și bolnave [44]. Cx43 este principala proteină de joncțiune în diferențierea și proliferarea adipocitelor. Inhibarea expresiei și funcției Cx43 induce diferențierea trans osteoblastică în adipocite și permite celulelor musculare să se diferențieze în adipocite [45]. Mai mult, inhibarea joncțiunilor gap asigură diferențierea celulelor osteoblaste în adipocite și expresia lipoproteinei lipazei și PPARγ2, rezultând acumularea de picături lipidice [46]. În procesul de diferențiere a preadipocitelor 3T3-L1, inhibitorul conexinei, interferența ARN 18α-GA sau Cx43 inhibă diferențierea celulelor 3T3-L1 și reduce nivelurile de expresie ale PPARγ2 și GLUT4 în adipocitele mature [23]. Prin urmare, joncțiunile de decalaj joacă un rol important în diferențierea adipocitelor și depunerea lipidelor.

Rezultatele noastre au arătat că activarea unui influx de calciu indus de TRPV1 a fost redusă în cazul inhibării Cx43. Studiile anterioare au arătat că starea de Ca 2+ între celule este afectată de ajustarea joncțiunii gap [47]; expresia conexinei afectează transmiterea informațiilor între celule, inclusiv transferul de Ca 2+ [48]. Afluxul de calciu și permeabilitatea ionilor de calciu sunt strâns legate, dat fiind că inhibitorii ATP dependenți de Ca 2+ reduc influxul tranzitor de Ca 2+. Alții au constatat că în miocitele neonatale cultivate la șobolani, inhibarea dominant-negativă (DN) a Cx43 afectează cuplarea intercelulară și tranzitorii Ca 2+ desincronizați între celulele individuale [49]. Starea canalelor de joncțiune gap este legată de valoarea pH-ului intracelular, modificările ionice, inhibarea AMPc, fosforilarea proteinei Cx și factorii genetici. Nivelul de Ca 2+ intracelular este unul dintre factorii importanți care afectează permeabilitatea expresiei conexinei. Concentrația intracelulară de Ca 2+ influențează funcția conexinei [50], iar supraîncărcarea intracelulară de calciu în miocitele ventriculare afectează funcția de cuplare între celule [51]. Astfel, activitatea Cx43 este afectată de Ca 2+ liber intracelular și reglează nivelurile de calciu intracelular.

Studiile noastre anterioare au arătat că capsaicina activează TRPV1 și promovează influxul extracelular de Ca 2+ [41,59], în timp ce prezentul studiu a arătat că activarea TRPV1 îmbunătățește funcția joncțiunilor gap, crește influxul extracelular de Ca 2+ și activează Cx43. Prin urmare, am arătat că activarea TRPV1 induce un aflux de calciu mediat de Cx43 și, în plus, că Cx43 a influențat nivelurile intracelulare de Ca 2+ pentru a promova lipoliza și remodelarea grăsimilor viscerale.

Concluzii

În concluzie, am furnizat noi dovezi că activarea TRPV1 de către capsaicina din dietă promovează remodelarea grăsimilor viscerale prin reglarea în sus a Cx43, care poate reprezenta o strategie nouă pentru gestionarea obezității. Astfel, capsaicina dietetică poate reprezenta o intervenție de viață promițătoare la populațiile cu risc crescut de obezitate.