Angelica Soares

1 Centrul de Științe Medicale și Farmaceutice, Universitatea de Stat din Vestul Paraná, R. Universitária, 1619, Cascavel, PR CEP 85819-110 Brazilia

intestinale

Evandro José Beraldi

2 Departamentul de Științe Morfologice, Universitatea de Stat din Maringá, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900 Brazilia

Paulo Emílio Botura Ferreira

2 Departamentul de Științe Morfologice, Universitatea de Stat din Maringá, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900 Brazilia

Roberto Barbosa Bazotte

3 Departamentul de farmacologie și terapie, Universitatea de Stat din Maringá, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900 Brazilia

Nilza Cristina Buttow

2 Departamentul de Științe Morfologice, Universitatea de Stat din Maringá, Av. Colombo, 5790, Maringá, PR CEP 87020-900 Brazilia

Abstract

fundal

Prevalența obezității a crescut la rate alarmante, în special din cauza consumului crescut de diete bogate în grăsimi (HFD). Influența HFD asupra inervației intrinseci și a peretelui intestinal nu a fost complet caracterizată. Scopul acestui studiu a fost de a investiga aspectele morfo-cantitative ale neuronilor myenterici și ale peretelui intestinului subțire la șoarecii hrăniți cu HFD.

Metode

Șoarecii elvețieni au fost hrăniți cu HFD (59% kcal din grăsimi) sau chow standard (9% Kcal din grăsimi) timp de 8 săptămâni. Segmente de duoden, jejun și ileon au fost supuse procesării histologice pentru examinarea morfo-cantitativă a peretelui intestinal și a celulelor mucoasei, iar imunohistochimia a fost efectuată pentru a evalua neuronii myenterici. Datele pentru fiecare segment au fost comparate între grupuri utilizând un test t al Student nepereche sau un test echivalent nonparametric.

Rezultate

HFD a crescut greutatea corporală și grăsimea viscerală și a scăzut lungimea intestinului subțire și circumferința ileonului. În duoden, HFD a crescut densitatea subpopulației nitrergice și a scăzut aria neuronilor nitrergici și a varicozităților peptidei intestinale vasoactive (VIP). În jejun, densitatea subpopulației nitrergice a fost crescută și zonele neuronale ale populației generale, subpopulația nitrergică și varicozitățile (VIP) au fost reduse. În ileon, densitatea populației generale și a subpopulației nitrergice au fost crescute, iar zonele neuronale ale populației generale, subpopulația nitrergică și varicozitățile (VIP) au fost reduse. Parametrii morfometrici ai vilozităților, criptelor, stratului muscular și peretelui total au crescut în general în duoden și jejun și au scăzut în ileon. În duoden și jejun, HFD a promovat o scădere a proporției limfocitelor intraepiteliale. În ileon, proporția limfocitelor intraepiteliale și a celulelor calice a scăzut, iar celulele enteroendocrine au crescut.

Concluzii

Dieta bogată în grăsimi induce modificări ale inervației myenterice a intestinului subțire, a peretelui intestinal și a celulelor mucoasei responsabile de secreția hormonilor și menținerea barierei intestinale de protecție. Datele morfo-cantitative oferă o bază pentru studii ulterioare pentru a clarifica influența HFD în motilitate, capacitatea digestivă și de absorbție și bariera intestinală.

fundal

Obezitatea este o provocare pentru sănătatea publică globală, în special în ceea ce privește asocierea cu boli cronice, cum ar fi diabetul, hipertensiunea, bolile cardiovasculare și cancerul [1]. Conform datelor globale, 14% dintre femeile adulte și 10% dintre bărbații adulți sunt obezi [1]. Creșterea ratelor de obezitate reflectă schimbările comportamentale din societatea modernă, inclusiv aportul mai mare de alimente bogate în grăsimi și cu o densitate mare de energie [2].

Consumul unei diete bogate în grăsimi (HFD), produsă de obicei cu 20-60% grăsimi [3], este asociat cu dezvoltarea obezității la oameni [2] și animale [3-5]. La animale, HFD induc, de asemenea, tulburări similare cu cele care apar la obezitatea umană, cum ar fi hiperglicemia [4], rezistența la insulină și diabetul de tip 2 [5].

Unele studii au raportat influența unui HFD asupra tractului gastro-intestinal. Cu toate acestea, răspunsurile sunt distincte atunci când sunt comparate diferite surse de grăsimi saturate (68:28 saturate: grăsimi monoinsaturate vs. 39:45 saturate: grăsimi monoinsaturate) [6,7] și când acestea sunt comparate cu grăsimi monoinsaturate ridicate (12:80 saturate: grăsimi monoinsaturate) [6]. De exemplu, în mucoasa intestinală, grăsimile saturate (39:45 saturate: mononesaturate) au crescut înălțimea villusului în jejun și ileon după doar 3 zile la animalele care au suferit rezecție intestinală [7], în timp ce grăsimile saturate ridicate (68:28 saturate: monoinsaturate) timp de 8,4 săptămâni înălțimea villusului redusă în aceleași segmente [6]. Grăsimea afectează, de asemenea, secreția de mucus, numărul de celule calice [8] și proliferarea celulară [7,8]. Aceste modificări pot afecta absorbția nutrienților și funcția de protecție a barierei mucoasei. În ceea ce privește populațiile de celule ale epiteliului intestinal, limfocitele intraepiteliale și bariera mucusului, produse în principal de celulele calicice, sunt legate de apărarea imună și pot fi afectate de HFD [9].

Celulele enteroendocrine sunt o altă populație de celule care este legată de absorbția nutrienților, care secretă hormoni gastrointestinali care funcționează într-un mod integrat pentru a optimiza digestia și absorbția [10]. În plus, dovezile indică faptul că aceste celule interacționează și cu sistemul nervos, pot activa circuitele neuronale locale și pot promova activitatea motorie, secretorie și vasodilatatoare [11].

Studiile anterioare au raportat influența grăsimii asupra motilității gastro-intestinale [12,13]. Patogeneza acestor modificări ar putea implica modificări ale inervației intrinseci reprezentate de sistemul nervos enteric. Studii recente au descris neuropatia mienterică după consumul de HFD [5,14]. Neuronii myenterici sunt afectați diferențial, iar subpopulațiile de neuroni care exprimă sintaza de oxid nitric neuronal (nNOS) și peptida intestinală vasoactivă (VIP) sunt deosebit de sensibile [5]. Datorită acestei relații intime, neuroplasticitatea mienterică poate fi însoțită de modificări structurale ale tunicii musculare și ale peretelui intestinal, ceea ce a fost sugerat în literatură [15,16].

Studiul de față a evaluat efectele unui HFD asupra populației neuronale generale (miozină-V-imunoreactivă [IR]) și nitrergice (nNOS-IR) și VIP-ergice (VIP-IR) subpopulații în plexul myenteric al intestinului subțire al șoareci. În plus, au fost studiate morfologia peretelui intestinal, proliferarea celulară și subpopulațiile de celule calice, celule enteroendocrine și limfocite intraepiteliale.

Metode

Animale și grupuri de studiu

Șoarecii elvețieni masculi (Mus musculus) au fost obținuți din Biotherium Central al Universității de Stat din Maringá. Animalele au fost menținute sub o temperatură controlată a camerei (22 ± 2 ° C) și 12 h/12 h ciclu lumină/întuneric și adăpostite în cuști separate. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimente pe animale de la Universitatea de Stat din Maringá și au respectat legile internaționale pentru protecția animalelor.

La vârsta de 42 de zile, animalele cântăreau în medie 34 g au fost distribuite în două grupuri cu câte 10 animale: animale de control (grup CON) care au fost hrănite cu chow standard pentru rozătoare (9% kcal din grăsime) (Nuvilab, Quimtia SA, Colombo, PR, Brazilia) și animale experimentale care au fost hrănite cu un HFD care conținea 59% kcal din grăsime timp de 8 săptămâni (grupul OB). HFD (Tabelul 1) a fost preparat folosind untură într-o compoziție care a fost exact aceeași cu cea folosită anterior de Arçari și colab. [4] și pe baza dietei purificate AIN-93G [17]. Untura de porc are aproximativ 40:40 saturate: grăsimi monoinsaturate și este bogată în acid palmitic, un triglicerid cu lanț lung. Cantitatea de acizi grași din chow-ul standard a fost de 4% din greutatea totală; în HFD, a fost de 35%. Ambelor grupuri li s-a permis accesul la hrană și apă ad libitum.

tabelul 1

Compoziția nutrițională a dietei standard de chow și bogată în grăsimi (HFD)

ChowHFD implicitg/100 g
Proteină2220
Carbohidrați5535
Grăsime totală435
Fibră75
Micronutrienți125
kcal/kg37735358

Colectarea intestinului

După 15 ore de post, animalele au primit 0,5 mg/kg de soluție de sulfat de vincristină cu 2 ore înainte de eutanasie (Tecnocris, Eurofarma, São Paulo, SP, Brazilia) intraperitoneal pentru a bloca mitoza din epiteliul intestinal. Animalele au fost cântărite și anesteziate intraperitoneal cu 80 mg/kg Tiopental (Abbott Laboratories, Chicago, IL, SUA) și au fost supuse laparotomiei pentru colectarea intestinului subțire și a depozitelor de grăsime periepididimale, retroperitoneale și mezenterice. Depunerile de grăsime au fost cântărite și au fost măsurate lungimile (de la pylori la joncțiunea ileo-cecală) ale intestinului subțire. Probele de duoden, jejun și ileon au fost deschise la marginea mezenterică imediat după recoltare și a fost măsurată circumferința intestinală. Din cele 10 animale din fiecare grup, cinci au suferit proceduri imunohistochimice, iar celelalte cinci au suferit proceduri histologice.

Tehnici imunohistochimice

Probele de duoden, jejun și ileon au fost spălate cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; 0,1 M, pH 7,4), legate la ambele capete, completate și distinse cu 4% paraformaldehidă tamponată (pH 7,4) timp de 2 ore. După fixare, probele au fost deschise la marginea mezenterică, spălate cu PBS și microdisecate sub un stereomicroscop. Tunicele mucoasei și submucoasei au fost îndepărtate, iar stratul muscular a fost reținut pentru a obține monturi întregi ale tunicii musculare care conținea plexul myenteric.

Monturile întregi au fost supuse unor tehnici imunohistochimice pentru observarea populației generale de neuroni mienterici miozină-V-IR, subpopulația de neuroni mienterici nNOS-IR și varicozități ale fibrelor nervoase ale neuronilor mienterici VIP-IR distribuiți în întregul mușchi circular.

Monturile întregi au fost spălate de două ori în PBS cu 0,5% Triton-X100 (PBS-T) și incubate în soluție de blocare care a constat din PBS-T, 2% albumină serică bovină (BSA) și 10% ser neimun de capră pentru 1 h la temperatura camerei. După blocare, monturile întregi au fost incubate cu anti-miozină-V [18], anti-nNOS sau anticorp primar anti-VIP (Tabelul 2) într-o soluție de incubare a PBS-T care conținea 2% BSA și 2% capră ser timp de 48 de ore la temperatura camerei cu agitare. Monturile întregi au fost spălate de trei ori în PBS-T și incubate timp de 2 ore la temperatura camerei într-o soluție de incubare care conținea anticorpul secundar (Tabelul 2) cu agitare. Au fost apoi spălate de trei ori în PBS-T și montate pe lamele de sticlă cu 10% PBS în glicerol.

masa 2

Anticorpi primari și secundari utilizați în imunoreacții pentru miozina-V, nNOS și VIP

AntibodyHostDilutionCompany
Miozina-V (primară)Iepure1: 200Buttow și colab. [18]
nNOS (primar)Iepure1: 500Zymed
VIP (primar)Iepure1: 500Peninsula Laboratories, Inc.
Anti-iepure IgG FITC (Secundar)Iepure1: 500Santa Cruz Biotecnology

Analiza cantitativă și morfometrică a neuronilor myenterici imunoreactivi

Analizele au fost realizate în imagini capturate cu o cameră de înaltă rezoluție AxioCam MRC (Carl Zeiss, Jena, Germania) cuplată la un microscop de fluorescență Axioshop Plus (Carl Zeiss, Jena, Germania) la 200 × (miozină-V-IR și nNOS- Neuroni IR) și mărire 400 × (varicozități VIP-IR). Imaginile au fost transferate pe un computer utilizând software-ul Axio Vision Rel (v. 4.6) și analizate folosind software-ul Image Pro Plus (v. 4.5, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, SUA).

Imaginile au fost capturate prin eșantionare aleatorie pe toate monturile întregi de pe diapozitivele histologice, fără câmpuri vizuale specifice alese și același câmp nu a fost capturat de mai multe ori. Neuronii imunoreactivi (miozina-V-IR și nNOS-IR) care au fost prezenți în 30 de imagini pe animal au fost numărate pentru fiecare segment. Aria fiecărei imagini a fost de aproximativ 0,36 mm2, iar aria totală cuantificată a fost de 10,93 mm2. Rezultatele sunt exprimate ca neuroni per cm2 .

Zonele a 100 de corpuri de celule neuronale (miozina-V-IR și nNOS-IR) per animal au fost măsurate pentru fiecare segment, pentru un total de 500 de neuroni în fiecare segment pe grup. Măsurătorile au fost făcute în neuroni unde a fost posibil să se vadă clar limitele corpului celulei. Pentru fiecare animal, zonele de 400 de varicozități care au fost găsite în mușchiul circular (VIP-IR) au fost măsurate pe animal în fiecare segment, pentru un total de 2.000 pe grup; varicozitățile suprapuse nu au fost măsurate. Rezultatele sunt exprimate în μm 2 .

Analiza morfometrică a peretelui intestinal

Probele de duoden, jejun și ileon au fost deschise la marginea mezenterică, spălate cu soluție salină, fixate în soluția Bouin timp de 6 ore, deshidratate în alcool, diafanizate în xilol și încorporate în parafină. Secțiunile longitudinale semi-seriale (intervale de 28 μm, grosime 4 μm) au fost supuse colorării hematoxilin-eozinei (HE).

Pentru a evalua înălțimea vilozității, adâncimea criptei și stratul muscular și grosimea peretelui intestinal (de la vârful vilozității la mezoteliul tunosului seros), 40 de măsurători per animal au fost efectuate aleatoriu de către un observator orb pentru fiecare variabilă din fiecare segment folosind Image Pro Plus Software de analiză a imaginii 4.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, SUA). Imaginile digitale au fost capturate cu o cameră de înaltă rezoluție (Q Color 3 Olympus American, Burnaby, BC, Canada) cuplată la un microscop (Olympus BX 41, Olympus, Tokyo, Japonia) utilizând software-ul Q Capture Pro 5.1.

Analiza cantitativă a proliferării celulare, a celulelor calice și enteroendocrine și a limfocitelor intraepiteliale

Analizele au fost efectuate cu secțiuni histologice semi-seriale care au fost colorate folosind următoarele metode. Metoda HE a fost utilizată pentru cuantificarea proliferării celulare utilizând indicele metafazic și cuantificarea limfocitelor intraepiteliale (IEL). Tehnica histochimică periodică a acidului-Schiff (PAS) a fost utilizată pentru a cuantifica celulele calice care conțineau mucine neutre [19]. Tehnica histochimică Grimelius care constă în impregnarea cu argint [20] a fost utilizată pentru cuantificarea celulelor enteroendocrine.

Celulele calicice și IEL-urile au fost cuantificate de-a lungul vilozităților. Numărul de celule calice sau IEL dintr-o parte a vilozității și numărul total de celule pe aceeași parte au fost numărate pentru un total de aproximativ 2.500 de celule pentru fiecare tehnică pe segment la fiecare animal. Numărul de celule enteroendocrine a fost numărat în mod similar în axa criptă-vilozitate pentru un total de aproximativ 2.500 de celule pe segment la fiecare animal.

Indicele metafazic a fost determinat prin numărarea numărului de celule la metafază de pe o parte a criptelor și a numărului total de celule de criptă pentru un total de aproximativ 2.500 de celule per animal pentru fiecare segment.

Cuantificările au fost efectuate folosind un microscop Zeiss Primo Star (Carl Zeiss, Jena, Germania) la o mărire de 400 ×. Datele sunt raportate ca număr de populații de celule specifice pe numărul total de celule înmulțit cu 100.

analize statistice

Tabelul 3

Parametri evaluați în grupul de control (grupul CON) și în grupul alimentat cu diete bogate în grăsimi (grupul OB)

CONOB
Greutate corporală (g)41,7 ± 1,347,7 ± 1,6 * a
Grăsime viscerală (g)1,6 ± 0,23,9 ± 0,3 *** a
Lungimea intestinului subțire (cm)56,8 ± 1,851,2 ± 1,3 * a
Circumferința duodenului (cm)0,6 ± 0,020,5 ± 0,05 b
Circumferința jejunului (cm)0,5 ± 0,020,5 ± 0,0002 b
Circumferința ileonului (cm)0,5 ± 0,020,3 ± 0,02 * b

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM (n = 10). * p un test t nepereche; b test nonparametric.

Morfologie și densitate neuronală

Indiferent de dietă, organizarea generală a plexului myenteric a fost neschimbată. Neuronii miozină-V-IR de diferite dimensiuni au fost aranjați în principal în ganglioni și rareori de-a lungul fibrelor nervoase (Figura 1). Subpopulația de neuroni nitrergici a fost localizată în principal periferic în ganglion (Figura 1).