Abstract

OBIECTIV - Extinderea masei țesutului adipos observată în obezitate implică atât hiperplazie, cât și hipertrofie a adipocitelor. Cu toate acestea, se știe puțin despre modul în care adipocitele, precursorii adipocitelor, vasele de sânge și celulele stromale interacționează între ele pentru a realiza adipogeneza.

obezitate

PROIECTARE ȘI METODE DE CERCETARE - Am dezvoltat o metodă confocală bazată pe microscopie de vizualizare tridimensională a țesutului adipos viu intact care ne permite să evaluăm simultan angiogeneza și adipogeneza la șoareci db/db.

REZULTATE - Am constatat că diferențierea adipocitelor are loc în grupuri de celule (pe care le-am desemnat grupuri de celule adipogene/angiogene) care conțin mai multe tipuri de celule, inclusiv celule endoteliale și celule stromale care exprimă CD34 și CD68 și leagă lectina. Au existat strânse relații spațiale și temporale între formarea vaselor de sânge și adipogeneză, iar încolțirea noilor vase de sânge din vasculatura preexistentă a fost cuplată cu diferențierea adipocitelor. Celulele care leagă lectina CD34 + CD68 + ar putea fi distinse clar de macrofagele CD34 - CD68 +, care au fost împrăștiate în stromă și nu au legat lectina. Clusterele de celule adipogene/angiogene pot fi distinse morfologic și imunohistochimic de structurile asemănătoare coroanei, frecvent observate în etapele târzii ale obezității țesutului adipos. Administrarea anticorpilor factorului de creștere endotelial anti-vascular (VEGF) a inhibat nu numai angiogeneza, ci și formarea de grupuri de celule adipogene/angiogene, indicând faptul că cuplarea adipogenezei și angiogenezei este esențială pentru diferențierea adipocitelor în obezitate și că VEGF este un mediator cheie a acestui proces.

CONCLUZII - Tehnicile de imagistică a țesuturilor vii oferă dovezi noi ale interacțiunilor dinamice dintre diferențierea adipocitelor, celulele stromale și angiogeneza în țesutul adipos obez viu.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

O versiune extinsă a secțiunii de proiectare și metode de cercetare este disponibilă în apendicele online „Materiale și metode” (disponibil la http://dx.doi.org/10.2337/db06-1749).

Imagistica țesutului viu.

Șoarecii db/db în vârstă de 8 săptămâni au fost separați în două grupe: un grup db/db + factor de creștere endotelială vasculară (VEGF) (căruia i s-a administrat subcutanat un anticorp monoclonal anti-VEGF [100 μg/șoarece] timp de 2 săptămâni înainte de experimentare) și un grup de control db/db (care a primit IgG nespecific).

Șoarecii au fost uciși prin luxație cervicală, după care grăsimea epididimală a fost îndepărtată folosind tehnici sterile și tocată în bucăți mici (∼2-3 mm) folosind un bisturiu. Bucățile de țesut au fost apoi spălate și incubate cu FM1-43, BODIPY, LDL acetilat conjugat cu Alexa Fluor sau Griffonia simplicifolia isolectin GS-IB4 conjugat cu Alexa Fluor. Nucleii au fost contracolorați cu Hoechst 33342.

Griffonia simplicifolia IB4 izolectina este o sondă histochimică utilă care etichetează în mod specific celulele endoteliale în multe specii și țesuturi, inclusiv țesutul adipos (19). Am confirmat aceste constatări prin dubla colorare a țesutului adipos cu anti-CD31 (moleculă de adeziune a trombocitelor/celule endoteliale) și lectină, care au produs modele de colorare identice (apendicele online Fig. 1).

Toate experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimente pe animale ale Universității din Tokyo și au respectat cu strictețe liniile directoare pentru experimentele pe animale ale Universității din Tokyo.

Microscopie confocală.

A fost utilizat un microscop confocal cu scanare laser (CSU22; Yokogawa-denki și LSM510 Meta; Carl Zeiss). Țesutul a fost excitat folosind linii laser cu mai multe culori și emisia a fost colectată prin intermediul filtrelor de bandă înguste adecvate. Fiecare imagine a fost produsă dintr-o medie de opt cadre, după care imaginile achiziționate au fost procesate pentru a produce un model tridimensional redat la suprafață.

Folosind acestea din urmă, am confirmat că fiecare adipocit din țesutul adipos este înconjurat de microvase care utilizează stive groase de 50 - μm, dar am găsit dificil să vizualizăm detaliile precise ale structurilor din cauza focalizării insuficiente în feliile profunde. Prin urmare, am ales să folosim în principal stive de + celule fără întreruperea membranei plasmatice. Histograma prezentată a fost construită din 1.000 de celule din fiecare grup. Pentru a calcula numărul de adipocite din plăcuțele de grăsime epididimale, volumul de grăsime a fost împărțit la numărul de celule determinat pe unitate de volum.

Pentru a cuantifica numărul de clustere de celule adipogene, au fost luate patru felii la intervale spațiale regulate din fiecare tampon de grăsime epididimală și au fost examinate imagini cu cinci câmpuri de putere redusă colorate cu BODIPY și lectină pentru fiecare felie. Au fost analizate patru animale în fiecare grup (un total de 80 de câmpuri de putere redusă pentru fiecare grup). S-a determinat numărul de clustere de celule adipogene/angiogene (definit prin prezența unor adipocite mici înconjurate de celule care leagă lectina și de vase de sânge). Am analizat cel puțin cinci câmpuri pe felie și patru felii pe masă de grăsime pentru a obține imagini reprezentative.

În experimentele preliminare, am confirmat că țesutul adipos a fost omogen din punct de vedere structural prin examinarea tampoanelor de grăsime la intervale spațiale regulate în db/+, iar grupurile celulare adipogene au fost, de asemenea, distribuite omogen în toate secțiunile luate din diferite părți ale tampoanelor de grăsime epididimale șoareci db/db (Apendice online Fig. 3).

Colorarea imunofluorescentă a bromodeoxiuridinei încorporate.

Șoarecilor li s-a administrat bromodeoxiuridină intraperitoneală (BrdU) (30 mg/kg corp greutate) cu 2 zile înainte de a fi uciși. Ulterior, țesutul adipos rezecat a fost fixat, permeabilizat, tratat cu dezoxiribonuclează și incubat cu izotiocianat de fluoresceină - anticorpi anti-BrdU conjugați.

Imunohistochimie.

Pentru analiza imunohistochimică, piesele de țesut izolate au fost fixate în 4% formaldehidă și permeabilizate cu 1% Triton X-100. Probele au fost apoi blocate cu 1% BSA și incubate cu o pereche de anticorpi primari și apoi cu un anticorp secundar. Anticorpii, coloranții, furnizorii, timpul de incubație și concentrația utilizate în prezentul studiu sunt rezumate într-un tabel de apendice online.

Statistici.

Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SEM. Semnificația statistică a diferențelor dintre cele două grupuri a fost determinată folosind testele t ale lui Student; diferențele între trei grupuri au fost evaluate utilizând testele ANOVA și post-hoc Bonferroni. Valorile P 6 vs. 1,71 ± 0,10 × 106 celule/tampon de grăsime, respectiv; n = 5 animale, celule P + puternic colorate pentru perilipină (Fig. 4B și 5), care este o proteină asociată cu picături lipidice specifice adipocitelor a cărei expresie este indusă în timpul diferențierii adipocitelor de preadipocite (21). Cinti et al. (22) au arătat că adipocitele pe moarte au fost negative pentru perilipină. 4) Nu am observat nici o colorare a markerilor de celule moarte în celulele mici BODIPY-pozitive (apendicele online Fig. 5). 5) Postul timp de 24 de ore nu a indus grupurile de celule care conțin adipocite mici și celule lectine + înconjurătoare (apendicele online Fig. 6).

Angiogeneza cuplată este esențială pentru adipogeneza obezității.

Pentru a caracteriza în continuare fenotipul de suprafață al celulelor care leagă lectina în grupurile de celule adipogene/angiogene, le-am examinat prin triplă colorare pentru markerii de suprafață CD31 (molecula 1 de adeziune a trombocitelor/celulelor endoteliale, un marker de celule endoteliale), marker macrofag F4/80 ) și perilipin (un marker adipocitar). Celulele mici care leagă lectina asociate adipocitelor au exprimat CD68 și F4/80 (apendicele online Fig. 10) și, când au fost colorate triplu pentru CD31, F4/80 și perilipină, F4/80 + celule mici asociate adipocitelor au fost, de asemenea, pozitive pentru CD31 (Fig. 5S). În contrast puternic, celulele endoteliale CD31 + din capilare nu au fost niciodată pozitive pentru F4/80. Deoarece celulele F4/80 + au fost negative pentru perilipină indică faptul că nu au fost adipocite. Astfel, au existat cel puțin două populații distincte de celule care leagă lectina în țesutul adipos obez: CD31 + CD68 - F4/80 - celule endoteliale care au compus vasele de sânge și CD31 + CD68 + F4/80 + celule care au înconjurat mici adipocite diferențiate. Caracteristicile celulelor care leagă lectina, macrofagelor stromale, celulelor endoteliale și adipocitelor din țesutul adipos sunt rezumate în Tabelul 1.

Clusterele de celule adipogene/angiogene sunt morfologic și imunohistochimic diferite de structurile asemănătoare coroanei.

La șoareci de 8 săptămâni db/db, marea majoritate a grupurilor de celule erau compuse din celule adipogene/angiogene (Fig. 6). Numărul de clustere de celule adipogene/angiogene a scăzut la șoareci de 12 săptămâni db/db, iar structurile asemănătoare coroanei au coexistat cu aceștia. La șoareci db/db în vârstă de 30 de săptămâni, s-au găsit foarte puține grupuri de celule adipogene/angiogene, în timp ce au fost observate o serie de structuri asemănătoare coroanei, ceea ce indică faptul că la stadiile târzii ale obezității, formarea de structuri asemănătoare coroanei apare frecvent în adipoase. țesut (22). În plus, grupurile de celule adipogene/angiogene sunt mecanismul major al hiperplaziei adipocitelor în stadiile incipiente ale obezității (Fig. 6E).

DISCUŢIE

În ciuda cunoștințelor detaliate despre mecanismele moleculare care controlează diferențierea adipocitelor in vitro, se știe puțin despre modul în care adipogeneza progresează in vivo, în special în ceea ce privește obezitatea. Imagistica noastră cu celule vii a dezvăluit că adipogeneza are loc în grupuri de celule adipogene/angiogene care conțin, de asemenea, diferite celule stromale și vase de sânge și că angiogeneza este o parte esențială a adipogenezei în obezitate.

Rezultatele noastre demonstrează două tipuri de celule CD68 +: celule CD34 + CD68 + asociate cu adipocite mici care diferențiază și macrofage CD34 - CD68 + împrăștiate în stromă. Deși ambele populații de celule sunt CD68 + și F4/80 +, ele pot reprezenta linii celulare diferite (Tabelul 1). Într-adevăr, fenotipul care include exprimarea CD34 și CD68, legarea lectinei și absorbția LDL acetilată se potrivește cu fenotipurile ambelor celule endoteliale supuse angiogenezei și celulelor progenitoare endoteliale (29). Cu toate acestea, celulele care leagă lectina CD34 + CD68 + nu au fost găsite în vasele de sânge și nu au prezentat caracteristicile morfologice ale celulelor endoteliale. Astfel, funcția și descendența acelor celule CD34 + CD68 + sunt în prezent necunoscute. Dar, având în vedere concluziile studiilor recente care arată că țesutul adipos conține celule stem multipotente (9), este tentant să speculăm că celulele CD34 + CD68 + s-ar putea diferenția în celule endoteliale și/sau alte tipuri de celule. Alternativ, acestea ar putea sprijini dezvoltarea adipocitelor mici și a angiogenezei. Producția de VEGF în aceste celule poate susține această ipoteză. Studiile viitoare ar trebui cu siguranță să caracterizeze în continuare descendența și funcția celulelor CD34 + CD68 +.

Imagistica noastră cu celule vii a țesutului adipos a relevat, de asemenea, o relație spațială și temporală strânsă între angiogeneză și adipogeneză. Această constatare este în concordanță cu cele din studiile anterioare care arată că inhibarea angiogenezei reduce masa țesutului adipos și ameliorează obezitatea și rezistența la insulină (13-16), deși aceste studii nu au clarificat modul în care inhibarea angiogenezei duce la reducerea masei grase. Studiile privind dezvoltarea țesutului adipos au arătat, de asemenea, că angiogeneza precede adipogeneza la embrioni (35). Cu toate acestea, nu a fost clar cum interacționează angiogeneza și adipogeneza și ce rol joacă vasele de sânge în adipogeneza în obezitate. Descoperirile noastre prezente arată în mod clar că încolțirea vaselor de sânge este în curs activ în vecinătatea grupurilor de adipocite diferențiate și celule CD34 + CD68 + asociate adipocitelor (Fig. 5). Mai mult, administrarea anti-VEGF a inhibat nu numai angiogeneza, ci și adipogeneza (figurile 1 și 2), care oferă dovezi directe că angiogeneza este esențială pentru adipogeneza obezității.

Studiile anterioare au arătat, de asemenea, că în timpul dezvoltării postnatale, expresia VEGF în țesutul adipos este corelată cu greutatea grăsimilor (36). Descoperirile noastre actuale aruncă lumină asupra mecanismului prin care VEGF afectează creșterea țesutului adipos. În plus față de inhibarea angiogenezei, administrarea anti-VEGF a inhibat și acumularea de celule CD34 + CD68 +, suprimând astfel formarea de grupuri de celule adipogene/angiogene (Fig. 5). Astfel, este probabil ca VEGF să mediază interacțiunile inițiale dintre vasele de sânge, celulele CD34 + CD68 + și precursorii adipocitelor. Faptul că receptorul VEGF-1 este necesar pentru recrutarea precursorilor hematopoietici și migrarea monocitelor și macrofagelor (37,38) susține acest model. Mai mult, Fukumura și colab. (16) a raportat recent că mediul condiționat de celulele endoteliale conținea VEGF și diferențierea accelerată a adipocitelor, în timp ce tratamentul cu un anticorp de blocare a receptorului VEGF 2 inhibă diferențierea adipocitelor. Prin urmare, este tentant să sugerăm că celulele CD34 + CD68 + asociate adipocitelor nu numai că accelerează angiogeneza, ci susțin și promovează diferențierea preadipocitelor prin interacțiuni paracrine (39-41).

Sunt reprezentate adipogeneza și angiogeneza cuplate în țesutul adipos viu. Țesut adipos viu nefixat de la șoareci martori de 8 săptămâni db/+ (A și B), șoareci de control db/db (C) tratați cu IgG, șoareci db/db (D) tratați anti-VEGF și 30 de săptămâni -soareci vechi db/db (E) au fost etichetați fie cu FM1-43 (A), fie cu lectină (roșu) pentru celulele endoteliale și BODIPY (albastru) pentru acidul gras (B - E). În țesutul adipos al șoarecilor db/db în vârstă de 8 săptămâni, au apărut un număr de celule mici BODIPY + înconjurate de celule lectină + care nu formau structura capilară. Rețineți că în țesutul adipos al șoarecilor db/db în vârstă de 30 de săptămâni au fost observate frecvent structuri asemănătoare coroanei (E; consultați și Fig. 6), în timp ce s-au găsit foarte puține grupuri de celule adipogene/angiogene. În dubla colorare pentru BODIPY și lectină, structurile asemănătoare coroanei au fost caracterizate de grupurile de lectină - macrofage care absorb BODIPY, care au apărut fără legătură cu încolțirea vaselor de sânge (C vs. E). După administrarea anticorpului anti-VEGF, angiogeneza a fost inhibată, iar numărul de adipocite mai mici a fost redus semnificativ (C vs. D). Barele reprezintă stive Z de 100 μm; 10 μm (A) și 5 μm (B - E).

Clustere de celule adipogene/angiogene vizualizate prin imagistica țesutului viu. Țesutul adipos viu nefixat de la șoareci de 8 săptămâni db/db a fost marcat cu o combinație de lectină (roșu) (A - F), BODIPY (albastru) (A - C), LDL acetilat (albastru) (D - F) și Hoechst 33342 (verde) (A - F). Imaginile reprezintă diferite etape de la migrarea perivasculară a lectinei + celulelor din jurul adipocitelor mici (A și D) către vasele de sânge care încolțesc (B, C, E și F) din vasculatura existentă. Tipul vasului care încolțește este clar vizibil (săgeți în B, E și F). Vederea laterală a unei imagini reconstituite tridimensionale demonstrează, de asemenea, fundatul fundalului vasului (F). Barele de scară reprezintă 20-μm, 30-μm (A și C - E), 4-μm (B) și stive Z de 40 μm (F).

Caracteristicile celulelor din țesutul adipos obez