Imunologie nutrițională

Editat de
Wilson Savino

Fundația Oswaldo Cruz (Fiocruz), Brazilia

Revizuite de
Zijian Zhang

Baylor College of Medicine, Statele Unite

Zhonghai Yan

Universitatea Columbia, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontieră

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Institutul de Microbiologie Medicală, Imunologie și Parazitologie, Spitalul Universitar Bonn, Bonn, Germania
  • 2 unitate pentru imunopatologie, Institutul de Chimie Clinică și Farmacologie Clinică, Spitalul Universitar Bonn, Bonn, Germania
  • 3 Centrul german de cercetare a infecțiilor (DZIF), site-ul partenerului Bonn-Köln, Bonn, Germania

Abstract grafic. Adiponectina diminuează inflamația celulelor T CD4 prin limitarea glicolizei. Nivelurile crescute de adiponectină în timpul dietei normale de chow limitează glicoliza celulelor Th1 și Th17, ceea ce reduce secreția de IFN-γ și IL-17 și are ca rezultat o sensibilitate îmbunătățită la insulină. La șoarecii cu dietă bogată în grăsimi, hiperglicemia cu reducerea concomitentă a adiponectinei crește glicoliza celulelor T, ducând la creșterea producției de IFN-γ și IL-17 și la rezistența la insulină. Administrarea de extracte filariale și infecția presupusă de filarie cresc nivelul adiponectinei, reduc producția de IFN-γ și IL-17 de către celulele T și îmbunătățesc sensibilitatea la insulină.

Introducere

Cu 2 miliarde de persoane supraponderale sau obeze raportate la nivel global în 2013, incidența obezității crește într-un ritm alarmant (1). Există un număr tot mai mare de dovezi care leagă celulele imune înnăscute în general și macrofagele în special de inflamație și rezistența la insulină (2). În timpul obezității, macrofagele se infiltrează în țesutul adipos în expansiune și trec de la un fenotip M2 antiinflamator predominant la un fenotip M1 proinflamator (3, 4). Rapoarte recente au identificat celulele T ca jucători cheie ai sistemului imunitar adaptiv în orchestrarea efectelor inflamatorii ale macrofagelor și prin aceasta promovând rezistența la insulină (5, 6).

În timpul obezității, un număr crescut de celule T de memorie apare în țesutul adipos (7) și epuizarea celulelor T în general sau în mod specific din țesutul adipos s-a dovedit că scade inflamația țesutului adipos la șoarecii obezi și îmbunătățește rezistența la insulină (7, 8 ). În plus față de celulele convenționale care prezintă antigen, cum ar fi macrofagele, celulele dendritice și celulele B, celulele neimune, cum ar fi adipocitele, exprimă molecule care prezintă antigen și împreună cu adipocitokine, pot regla activarea celulelor T în țesutul adipos (9, 10). Cu toate acestea, nu există o înțelegere clară a modului în care răspunsurile imune ale celulelor T sunt modulate în timpul obezității și modul în care celulele care prezintă antigen convențional și neconvențional modulează inflamația celulelor T.

Factorii solubili secretați de adipocite, cum ar fi lipidele și adipocitokinele, inclusiv leptina sau adiponectina și evenimentele lor de semnalizare din aval pot modula celulele T (10, 11). O altă fațetă a reglării funcției celulelor T mediată de adipocitokine este influența lor asupra cerințelor nutriționale ale acestor celule care, la rândul lor, își controlează strâns funcția metabolică. Funcția celulelor T efector este alimentată de glucoză prin glicoliză aerobă, care este din ce în ce mai disponibilă în rezistența la insulină (12). Leptina s-a dovedit recent a fi un factor crucial pentru menținerea efectelor metabolice ale celulelor T activate (13), iar hipoleptinemia indusă de repaus alimentar a scăzut producția de IFN-γ și IL-17 și exprimarea unei enzime glicolitice cheie în celulele Th17 în timpul encefalomielita autoimună experimentală (14). Deși s-a demonstrat că adiponectina reglează activitatea celulelor T prin modularea funcțiilor celulelor dendritice (10), nu este încă clar, dacă adiponectina reglează direct activitatea celulelor T.

În trecutul recent, ipoteza igienei a fost extinsă de la alergice la boli metabolice, cum ar fi obezitatea și diabetul (15), deoarece mai multe studii la om au arătat o asociere inversă între infecția cu helminți și diabet (16, 17). În mod similar, studiile experimentale efectuate pe animale au dovedit că infecția cu helminți sau produsele derivate din helminți îmbunătățesc tulburările metabolice ale obezității (18, 19). Majoritatea studiilor au arătat că infecția cu helminți sau produsele derivate din helminți înclină mediul imunitar al țesutului adipos către un fenotip imunoregulator cu o expansiune a macrofagelor M2, eozinofile, celulelor T reglatoare și limfocitelor înnăscute de tip 2 (ILC2), care pot ameliora adiposul inflamația țesuturilor (15, 20). Am raportat că infecția cu nematodul filarial al rozătoarelor Litomosoides sigmodontis sau administrarea de brut L. sigmodontis extractul de viermi adulți (LsAg) îmbunătățește toleranța la glucoză la șoarecii obezi (19). În studiul de față, am demonstrat că tratamentul cu LsAg modulează activarea celulelor T CD4 + în timpul obezității printr-un mecanism mediat de adiponectină și oferă dovezi ale rolului potențialului adiponectin adiponectin sensibilizant la insulină în reglarea funcției celulelor T prin restrângerea glicolizei Th1 și Th17 în timpul grăsimii ridicate. dieta (HFD).

Materiale și metode

Declarație de etică

Condițiile de adăpostire a animalelor și procedurile utilizate în această lucrare au fost efectuate în conformitate cu orientările Uniunii Europene privind bunăstarea animalelor. Toate protocoalele au fost aprobate de Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Köln, Germania (84-02.04.2016.A331).

Toți șoarecii au fost menținuți în cuști ventilate cu un ciclu de 12 zile/noapte, alimente și apă ad libitum. Experimentele au fost efectuate cu șoareci masculi C57BL/6J cumpărați de la Janvier Labs (Le Genest-St.-Isle, Franța). Șoarecii au fost întreținuți la facilitățile pentru animale din Spitalul Universitar Bonn și au fost hrăniți fie cu dietă normală de chow (NCD) (15% grăsime), fie cu HFD (informații calorice: 60% kilocalorii grăsime; 20% carbohidrați și 20% proteine; Research Diets, Inc., Brogaarden, Danemarca). Șoarecii masculi de șase săptămâni au fost hrăniți cu HFD timp de 12-16 săptămâni, iar șoarecii martor au primit NCD.

Test de toleranță la glucoză și toleranță la insulină

După 6 ore de post, s-a efectuat testul de toleranță la glucoză (GTT). Șoarecii au fost administrați intraperitoneal (i.p.) cu 1 g glucoză/kg greutate corporală. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate din sângele venei cozii la 0, 30, 60 și 120 de minute după administrarea glucozei folosind un glucometru din sânge (AccuCheck Advantage; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania). Testul de toleranță la insulină (ITT) a fost efectuat la 4 ore după post. O unitate de insulină/kg greutate corporală a insulinei umane (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germania) a fost i.p. nivelurile de glucoză din sânge injectate și injectate au fost măsurate la 0, 30, 60 și 120 min după administrarea insulinei. Zona de sub curbă (AUC) a fost obținută prin calcularea ariei dintre axa x și o curbă dată utilizând software-ul GraphPad Prism (versiunea 5.03; GraphPad Software, San Diego, California, SUA).

Fracția vasculară stromală și izolarea splenocitelor

Doisprezece până la șaisprezece săptămâni după HFD, sângele a fost preluat de la control și șoarecii hrăniți cu HFD prin străpungerea venei faciale cu lancete (Goldenrod, Braintree Scientific, Braintree MA, SUA). Sângele a fost transferat direct în tuburile EDTA. Sângele a fost centrifugat la temperatura camerei și plasma a fost păstrată la -80 ° C până la utilizare.

Ulterior, șoarecii au fost eutanasiați prin inhalarea supradozajului de izofluran (Forene®, Abbolt, Wiesbaden, Germania). După disecarea pielii și peritoneului șoarecilor eutanasiați, grăsimea epididimală a fost excizată și păstrată în medii DMEM reci cu gheață (Gibco, Thermo Fischer Scientific; Darmstadt, Germania). Splina a fost îndepărtată chirurgical și păstrată în mediu RPMI-1640 rece ca gheața (Gibco)

Fracția vasculară stromală (SVF) a fost izolată de la șoareci NCD și HFD așa cum s-a descris în altă parte (8). Pe scurt, tamponul de grăsime epididimal a fost excizat de la șoarecii mici, tocat și digerat cu 0,2 mg/ml de colagenază (Sigma-Aldrich; Taufkirchen, Germania) conținând mediu DMEM timp de 40 de minute la 37 ° C cu agitare constantă. Adipocitele plutitoare au fost îndepărtate și peleta SVF a fost filtrată printr-un filtru de 40 μm după liza globulelor roșii (Invitrogen, Thermo Fischer științific).

Suspensia cu o singură celulă din splină a fost preparată prin forțarea mecanică a splenocitelor printr-un filtru de celule de 70 μm (BD Biosciences; Heidelberg, Germania) folosind pistoni cu seringă. Celulele roșii din sânge au fost apoi lizate folosind ACK Lysing Buffer (Thermo Fischer Scientific) (21). Celulele au fost utilizate pentru cultură și citometrie în flux după obținerea numărului de celule.

Cultură de celule

După enumerarea numărului de celule din suspensia de celule unice SVF și splenocite, celulele au fost cultivate în plăci de cultură tisulară cu 12 godeuri la concentrații de 1 × 106/ml în prezența acetatului de miristor de forbol (PMA) (50 ng/ml) și ionomicină (1 μg/ml) timp de 6 ore în mediu RPMI-1640 (Gibco) la 37 ° C. După 2 ore, Golgi Stop/Golgi Plug (BD Biosciences) a fost adăugat cu 4 ore înainte de recoltarea celulelor.

Celulele T CD4 + au fost izolate din splenocite de șoareci NCD sau HFD folosind microbere conform protocolului producătorului (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germania). Pe scurt, suspensia cu celule unice de splenocite a fost incubată cu 10 pl de microbii CD4 timp de 10 minute la 4 ° C și celulele T CD4 + au fost sortate folosind separatorul autoMACS Pro. Fracția negativă a fost incubată cu microbere CD8 + și celulele T CD8 + au fost sortate.

Celulele T splenice CD4 + izolate de la șoareci NCD sau HFD au fost cultivate cu adipocitokine și acizi grași în concentrațiile raportate anterior prezentate mai jos. Celulele T au fost stimulate cu anti-CD3 (5 μg/ml) și anti-CD28 (2 μg/ml) în prezența adiponectinei (5 μg/ml) (Peprotech; Hamburg, Germania) (22), leptină (250 ng/ml) (Peprotech) (13, 23), acid palmitic (Sigma-Aldrich) (0,5 mM) (24) și acid oleic (100 μM) (Sigma-Aldrich) (25).

Adipocite - Co-cultură de celule T

Izolarea adipocitelor s-a făcut așa cum s-a descris anterior (26). Pe scurt, 100 mg de țesut adipos au fost digerate cu colagenază, adipocitele au fost spălate de trei ori cu mediu proaspăt. Adipocitele de la șoareci NCD sau HFD au fost cultivate cu celule T CD4 + splenice purificate sau cu celule T CD8 + la concentrații de 0,5 × 106/ml (Miltenyi Biotec) de la șoareci NCD sau HFD așa cum s-a descris anterior (27) în prezența anti -CD3 și anti-CD28, precum și Golgi Stop/Golgi Plug (BD Biosciences) timp de 4 ore. Experimentele Transwell au fost efectuate prin plasarea adipocitelor NCD sau HFD în camera superioară și celulele T CD4 + în camera inferioară. Godeurile de control au avut doar celule T fără adipocite. Celulele T au fost tratate cu anti-CD3 și anti-CD28 și Golgi Stop/Golgi Plug.

Macrofage și epuizarea celulelor B.

În prima săptămână de HFD, macrofagele și celulele B au fost epuizate așa cum s-a descris în altă parte (28, 29). Macrofagele au fost epuizate de i.p. injectarea a 150 μl de lipozomi clodronati (Clodronate Liposomes Foundation; Olanda; http://clodronate.liposomes.com) și șoarecii martori au primit volume egale de lipozomi PBS. La trei zile după injectarea inițială, a fost administrată a doua doză, iar izolarea SVF a fost efectuată la 16 săptămâni după începerea HFD. Depleția celulelor B a fost efectuată folosind anticorp mCD20 anti-șoarece (Biogen; clona 18B12, izotipul IgG2a). S-au injectat 250 μg de anticorp urmat de o a doua injecție 4 zile mai târziu în faza incipientă a HFD.

Western Blot

Celulele T CD4 + de la șoareci NCD și HFD au fost cultivate cu anti-CD3 și anti-CD28 timp de 15 minute și celulele au fost lizate în tampon RIPA (Thermo Fisher Scientific) pentru extracția proteinelor. Separarea proteinelor a fost făcută prin SDS-PAGE și transferată pe o membrană de nitroceluloză. Membrana a fost incubată cu anticorpi primari pentru pAMPK sau β-actină (Cell Signaling Technology; Frankfurt, Germania) peste noapte. Apoi membrana a fost incubată cu un anticorp secundar conjugat cu HRP (Cell Signaling Technology) timp de 1 oră. Substratul Pierce ™ ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific), sistemul de imagistică VersaDoc 5000 (Bio-Rad; Hercules, CA, SUA) și programul Image J au fost utilizate pentru detectare, vizualizare a membranelor și respectiv cuantificare.

Purificarea celulelor T

La douăsprezece până la 16 săptămâni după HFD sau NCD, celulele T CD4 + splenice au fost izolate prin separare de celule magnetice (MACS) folosind kitul Miltenyi. Celulele T CD4 + purificate au fost incubate cu bloc Fc (Thermo Fisher Scientific) urmate de colorare cu CD4-PE-Cy7, CXCR3-FITC, CCR4-PE și CCR6-APC timp de 30 de minute în întuneric. Toți anticorpii au fost obținuți de la Biolegend (Fell, Germania). Celulele moarte au fost excluse prin colorare DAPI (BD Biosciences) și celulele Th1 (CD4 + CXCR3 + CCR6–) și celulele Th17 (CD4 + CCR4 + CCR6 + CXCR3–) au fost purificate folosind sortatorul de celule BD FACS Aria III (BD) Biosciences).

PCR în timp real

Celulele Th1 și Th17 sortate de la șoareci NCD și HFD au fost depozitate în 350 μl tampon RLT (Qiagen; Hilden, Germania) la -80 ° C. ARN-ul total a fost extras din celulele Th1 și Th17 purificate folosind mini kitul RNeasy (Qiagen). ARN-ul total a fost transcris invers cu kitul Omniscript RT (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului cu primeri oligo-d (T) (Roche; Penzberg, Germania). PCR în timp real a fost realizat cu Thermo Fisher QuantStudio 5 folosind mixul master universal TaqMan PCR (Thermo Fischer Scientific). Sonde TaqMan pentru hexokinază 1 (hk1), piruvat kinaza (pkm), lactat dehidrogenază (ldh), transportor de glucoză-1glut-1), receptorul adiponectinei-1 (adipor1) au fost analizate și hipoxantină-guanină fosforibosiltransferază (hprt) a fost utilizat ca control endogen (Thermo Fisher Scientific). Metoda CT relativă (ciclul de prag la faza exponențială de amplificare) a fost utilizată pentru a calcula rezultatele qPCR. Delta CT a fost calculată ca CT (gena de interes) - CThprt). Schimbarea ori a fost calculată ca 2 −ΔCT așa cum s-a descris anterior (30).

Diferențierea celulelor Th1 și Th17

Celulele T CD4 + naive splenice (CD4 + CD62L + CD44–) de la șoareci HFD au fost izolate conform instrucțiunilor producătorului (Miltenyi Biotec). Diferențierea celulelor T CD4 + naive în celulele Th1 și Th17 au fost efectuate așa cum s-a descris anterior cu unele modificări (31, 32). Pe scurt, plăcile de cultură cu 48 de godeuri au fost acoperite cu anti-CD3 (1 ug/ml) și anti-CD28 (5 ug/ml) în PBS și incubate timp de 3 ore la 37 ° C. Celulele T CD4 + naive purificate (0,5 × 106 celule/godeu în 0,5 ml de RPMI) au fost diferențiate în celule Th1 în prezența IL-12 (Peprotech) și IL-4 anti-șoarece (Peprotech) la concentrații de 3 și respectiv 10 μg/ml, timp de 96 de ore în RPMI conținând 10% FCS (Gibco). Pentru diferențierea celulelor Th17, celulele T naive au fost incubate cu IL-6 (Peprotech) și TGFβ1 (Peprotech) la 20 ng/ml și 1 ng/ml în mediu RPMI complet timp de 96 de ore.

Analiza Seahorse

Pentru a analiza rata de acidificare extracelulară (ECAR; în mpH/min), a fost utilizat analizorul de flux extracelular metabolic Seahorse XF e 96 (Seahorse Bioscience; North Billerica, MA, SUA). Celulele Th1 și Th17 diferențiate au fost cultivate în mediu XF (Agilent; Ratingen, Germania) suplimentat cu 10% FCS și 10 mM glucoză (Thermo Fischer Scientific) și analizate cu un analizor de flux extracelular XF-96. Au fost înregistrate cel puțin trei măsurători consecutive după stimularea cu anti-CD3/anti-CD28 urmată de adăugarea a 5 μg/ml de adiponectină și 10 μM compus C (Merck Millipore, Darmstadt, Germania) (22) pentru a inhiba semnalizarea AMPK.

LsAg Tratament

LsAg a fost preparat așa cum s-a descris anterior (33). Pe scurt, L. sigmodontis viermii adulți au fost recoltați din cavitățile toracice ale gerbilelor infectate și omogenizați mecanic pe gheață în PBS fără endotoxine (PAA; Pasching, Austria). Supernatantul a fost colectat și cuantificarea proteinelor a fost realizată prin testul Bradford (Cytoskeleton; Denver, CO., SUA). Alicote de LsAg au fost stocate pentru utilizare ulterioară la -80 ° C.

Tratamentul cu LsAg a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (19). Zilnic i.p. injecții de 2 μg LsAg pe șoarece timp de 2 săptămâni au fost administrate șoarecilor obezi în timpul săptămânilor 14-16 de HFD. Șoarecii martori corespunzători au primit injecții cu PBS. După ultima injecție cu LsAg, s-au efectuat studiile GTT și imunologice.

Cultura media condiționată

Celulele T CD4 + de la spline de șoareci obezi au fost cultivate în medii condiționate de adipocite de la șoareci tratați cu PBS sau LsAg cu PMA și ionomicină așa cum s-a descris mai sus. Pentru experimentele de neutralizare a adiponectinei, mediul condiționat cu adipocite a fost tratat peste noapte cu 10 μg/ml de anticorp neutralizant adiponectină (anti-adiponectină, AF1119, anti-mAcrp30; R&D Systems, Minneapolis, MN., SUA) sau controlul izotipului anti-capră IgG 10 μg/ml; Sisteme de cercetare și dezvoltare) (34). Acest mediu neutralizat a fost utilizat pentru a cultiva celule T CD4 + de la șoareci HFD în prezența PMA/ionomcicină.

Calculul insulinei ELISA și HOMA-IR

Insulina plasmatică de post a fost măsurată conform protocolului producătorului (Crystal Chem; IL, SUA). Evaluarea modelului de homeostazie a rezistenței la insulină (HOMA-IR) a fost obținută prin înmulțirea glucozei la jeun [mmol/l] cu nivelurile de insulină la jeun [μU/ml] urmată de împărțirea la 22,5 (35).

Adiponectin ELISA

Adipocitele au fost izolate din aceeași greutate a țesutului adipos de la șoareci tratați cu PBS și LsAg. Adipocitele izolate au fost cultivate peste noapte și mediile condiționate de adipocite (ACM) au fost colectate și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Nivelurile de adiponectină au fost măsurate în plasmă și ACM de către ELISA conform instrucțiunilor producătorului (sistem de cercetare și dezvoltare; Wiesbaden-Nordenstadt, Germania).

Citometrie în flux

Statistici

Analizele statistice au fost efectuate cu software-ul GraphPad Prism versiunea 5.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA). Diferențele dintre două grupuri nepereche au fost testate pentru semnificația statistică cu Mann-Whitney-U-Test. P-valori de ** p * p Cuvinte cheie: adiponectină, obezitate, celule T, inflamație, filarioză, helmint, glicoliză, țesut adipos

Citație: Surendar J, Frohberger SJ, Karunakaran I, Schmitt V, Stamminger W, Neumann AL, Wilhelm C, Hoerauf A și Hübner MP (2019) Adiponectina limitează IFN-γ și IL-17 Producând celule CD4 T în obezitate prin restrângerea celulelor intrinseci Glicoliza. Față. Immunol. 10: 2555. doi: 10.3389/fimmu.2019.02555

Primit: 14 iunie 2019; Acceptat: 15 octombrie 2019;
Publicat: 29 octombrie 2019.

Wilson Savino, Fundația Oswaldo Cruz (Fiocruz), Brazilia

Zhonghai Yan, Universitatea Columbia, Statele Unite
Zijian Zhang, Colegiul de Medicină Baylor, Statele Unite