ABSTRACT

Sporii Bacillus subtilis sunt folosiți pentru bacterioterapia orală și bacteriofilaxia tulburărilor gastrointestinale atât la oameni, cât și la animale. Deoarece B. subtilis este un saprofit aerob, modul în care sporii pot beneficia microbiota intestinală este o întrebare interesantă, deoarece alte probiotice, cum ar fi Lactobacillus spp. care colonizează intestinul sunt anerobi. Ca prim pas în înțelegerea efectelor potențiale ale ingerării de spori, am caracterizat cinci produse comerciale. O analiză biochimică, fiziologică și filogenetică extinsă a relevat că patru dintre aceste produse sunt etichetate greșit. Mai mult, patru dintre aceste produse au prezentat niveluri ridicate de rezistență la antibiotice.

caracterizarea

Probioticele sau „bacteriile prietenoase” devin din ce în ce mai accesibile publicului ca alimente funcționale benefice care pretind să promoveze beneficii specifice pentru sănătate pentru consumatori (2, 14, 18). În unele țări, probioticele sunt disponibile pentru bacterioterapie orală și bacterioprofilaxie a tulburărilor gastrointestinale la om. De multe ori aceste tulburări, dintre care multe duc la diaree, sunt rezultatul direct al utilizării antibioticelor, care produce un dezechilibru în compoziția florei microbiene intestinale normale. În industria zootehnică, utilizarea probioticelor are potențial ca alternativă la antibiotice prin excluderea competitivă a microorganismelor patogene (19), unele produse comerciale, cum ar fi Paciflor, sunt deja disponibile. Cele mai frecvent utilizate bacterii ca probiotice includ bacteriile lactice (de exemplu, lactobacili, enterococi, streptococi și bifidobacterii). Dovezile experimentale sugerează acum că ingestia unui număr substanțial de bacterii dăunătoare oferă într-adevăr un efect benefic florei enterice (18). Tocmai modul în care se realizează acest lucru și dacă revendicările comerciale sunt justificate rămâne o problemă controversată, deși (14).

Pe lângă bacteriile lactice, speciile de Bacillus sunt vândute și ca probiotice. Acestea constau din preparate de spori bacterieni, cu potențialul avantaj că sporii pot supraviețui tranzitului prin stomac intacte. Speciile de Bacillus sunt substanțial diferite de alte bacterii probiotice, totuși, fiind în primul rând saprofite aerobe găsite în sol. Dacă într-adevăr au beneficii pentru sănătate, atunci o întrebare evident importantă este cum? Sporii germinează și colonizează intestinul, exclud competitiv colonizarea prin potențiali agenți patogeni sau sporul latent oferă un stimul unic microbiotei intestinale, cum ar fi imunitatea locală îmbunătățită?

Într-un studiu anterior am arătat că un probiotic major de bacil comercializat în Europa conținea spori ai unei specii de Bacillus fără legătură taxonomică și filogenetică (4). Acest lucru a fost surprinzător, având în vedere că în Europa probioticele trebuie să fie autorizate pentru a fi utilizate ca aliment funcțional sau nou.

În această lucrare am examinat și caracterizat cinci probiotice din sporul Bacillus comercial ca un prim pas în înțelegerea naturii probioticelor din spori.

MATERIALE ȘI METODE

Tulpini bacteriene. Bacteriile au fost recuperate prin suspendarea preparatelor probiotice uscate în apă distilată, urmate de diluare și placare în serie pe agar de sporulare Difco (11). Preparatele comerciale și producătorii au fost după cum urmează: Lactipanplus (Istituto Biochimico Italiano S.p.A., Milano, Italia), Domuvar (Consorzio Farmaceutico e Biotecnologico Bioprogress a.r.i., Anagni-FR, Italia), Bactisubtil Marion Merrell S.A. Bourgoin-Jallieu, Franța), Biosubtyl, (Institutul Național de Vaccinuri și Substanțe Biologice, Da Lat, Vietnam) și Subtyl (Fabrica Farmaceutică 24, Ho Chi Minh City, Vietnam). Ca aB s-a folosit un Bacillus subtilisstrain validat, PY79 (20), un derivat al tulpinii 168. tulpina de tip subtilis.

Depuneri de tulpini. Toate tulpinile caracterizate în această lucrare au fost depuse la Bacillus Genetic Stock Center (BGSC), Ohio State University, Columbus (http://bacillus.biosci.ohio-state.edu/). (Numele desemnate de BGSC sunt date în tabelul 5.)

Teste biochimice. Kitul API 50 CH (BioMerieux), cuprinzând 49 de teste biochimice unice adecvate pentru Bacillus spp., A fost utilizat pentru diagnostic așa cum este descris în instrucțiunile producătorului. Testul complet a fost efectuat de cinci ori pentru fiecare tulpină. Hidroliza amidonului a fost așa cum s-a descris anterior (3). Creșterea la pH 10,1 a fost prin metoda lui Horikoshi și Teruhiko (7), folosind Na2CO3 pentru a ajusta pH-ul. Sporularea a fost indusă prin epuizarea nutrienților folosind mediu de sporulare Difco și măsurători ale sporilor rezistenți la căldură s-au făcut așa cum s-a descris anterior (11).

Microscopie electronică. Suspensiile de bacterii sporulante (din culturi de plăci vechi de 4 zile) au fost fixate în glutaraldehidă 3% plus 4% paraformaldehidă în 0,1, M PIPES [piperazină-N, N'-bis] (acid 2-etansulfonic) tampon (pH 7,2) conform metodei 1 din Page și colab. (12) Secțiunile de argint ale materialului încorporat în rășină Spurr au fost colorate cu acetat de uranil urmate de pata de plumb Reynolds și vizualizate pe un microscop electronic de transmisie Zeiss EM 109.

Testarea antibioticelor. Culturile de plăci proaspete cultivate pe mediu Luria-Bertani (LB) au fost folosite pentru a produce suspensii bacteriene cu o densitate de aproximativ 0,5, ajustate utilizând standardele McFarland. Plăcile Mueller-Hinton (Merck; standard NCCLS) au fost însămânțate folosind tampoane. Discurile impregnate cu antibiotice (diametru 6 mm; Oxoid) au fost plasate pe plăcile însămânțate și după 18 ore de creștere la 37 ° C, s-au măsurat zonele de inhibare. Acele tulpini care prezintă o zonă de inhibare cu diametrul mai mic de 12 mm au fost caracterizate în continuare pentru MIC a antibioticului necesar pentru a inhiba creșterea celulară. MIC-urile au fost determinate folosind culturi cultivate în bulion Mueller-Hinton.

Analiza filogenetică. Două oligonucleotide au fost folosite pentru a amplifica întregul ARNr 16S [P1 [5'-GCGGCGTGCCTAATACATGC] recoacere la nucleotide [nt] 40 până la 59 și P2 (5'-CACCTTCCGATACGGCTACC] recoacere la nt 1532 până la 1513, ofB. Produsul PCR cu 1.400 de baze a fost secvențiat în întregime folosind un secvențiator automat și oligonucleotidele P1, P2, P3 (5'-ACGCCGCGTGAGTGATGAAG-3 ') (recoacere la nt 404 până la 423 din B. subtilis rrnE) și P4 (5' -CATCTCACGACACGAGC-3 ′) (se reface la nt 1093 până la 1076 ofB. Subtilis rrnE). Genele pentru ARNr 16S au fost aliniate utilizând programul Clasl1W (EMBL Outstation http://www2.ebi.ac.uk/clastlw/), iar alinierea a fost utilizată pentru a construi arbori filogenetici cu pachetul software Phylip de la Pasteur Institute (http: //bioweb.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/). Arborele reprezintă asemănări între genele ARNr 16S.

Numere de accesare secvență nucleotidică. Secvențele genei 16S ARNr recuperate au fost depuse în GenBank cu următoarele numere de acces: Domuvar, AJ277904; Lactipan plus, AJ277905; Subtyl, AJ277906; Biosubtil "Dalat", AJ277907; Bactisubtil, AJ277908 .

REZULTATE

Creșterea tulpinilor probiotice. Tulpinile bacteriene au fost cultivate la 37 ° C în mediu LB (A) sau mediu de sporulare Difco (B). Tulpinile au fost B. subtilis PY79 (●), Bactisubtil (○), Subtyl (▴), Biosubtyl „Dalat” (Δ), Domuvar (▪) și Lactipanplus (➢). OD595, densitate optică la 595 nm.

Caracteristicile tulpinilor probiotice Bacillus

Sporulare. Este prezentată microscopia cu contrast de fază a culturilor cultivate în mediu de sporulare Difco examinată la aproximativ 12 ore după inițierea sporulării. În sensul acelor de ceasornic, din stânga sus, B. subtilis PY79, Lactipan plus, Subtyl, Biosubtyl „Dalat”, Bactisubtil și Domuvar.

Examinarea sporilor fiecărei tulpini prin microscopie electronică a relevat un exosporium în sporii maturi de Domuvar, Bactisubtil și Biosubtil "Dalat" (Tabelul 1). Exosporiul este o structură slab definită, care se găsește adesea lipită de stratul exterior de acoperire (1, 16). Sporii subtili au avut un aspect cel mai neobișnuit (Fig.3) și nu s-au colorat bine cu acetat de uranil. Sporii subtili păreau totuși să conțină un strat exosporial care a fost vărsat în mediul înconjurător. Acest lucru este prezentat în Fig.3 și, deși este foarte speculativ, este posibil ca acest material acoperit să producă agregatul observat în creșterea lichidă.

Microscopia electronică a unui spor Subtyl matur. Se crede că materialul vărsat din spori provine din stratul exosporial asociat cu stratul exterior de acoperire. Bară, 0,2 μm. EX, exosporium; OC, strat exterior.

Rezistență la antibiotic. Am examinat rezistența fiecărei tulpini probiotice la o selecție de antibiotice folosind testul de difuzie a discului (Tabelul 2). Acele tulpini care au prezentat zone mici de inhibare (mai puțin de 12 mm) au fost considerate rezistente și evaluate în continuare pentru a stabili MIC. Au fost identificate niveluri substanțiale de rezistență la mai multe antibiotice, după cum se arată în tabelul 3. Toate tulpinile, inclusiv B. subtilis PY79, s-au dovedit a avea un nivel bazal de rezistență la spectinomicină (30 până la 60 μg/ml). Deși rezultatele au fost neconcludente, nu am reușit să identificăm plasmidele din tulpinile rezistente la antibiotice, sugerând că rezistența la medicamente poate fi suportată de cromozomi (datele nu sunt prezentate).

Rezistențe la antibiotice a

Analiza filogenetică și identificarea speciilor. Examinarea inițială a tulpinilor probiotice a arătat o eterogenitate substanțială și a indicat că cel puțin unele sunt puțin probabil să fie B. subtilis. Ca prim pas, am folosit testul API CH 50 pentru a identifica speciile. Acest test generează o identificare a speciei ca procentaj de probabilitate, iar acuratețea crește de câte ori se repetă testul. Rezultatele noastre prezentate în Tabelul 4 au identificat Lactipan plus ca fiind cel mai probabil să fie B. subtilis și Subtyl, Bactisubtil și Biosubtyl „Dalat” ca fiind cel mai probabil să fie B. cereus. Cu toate acestea, Domuvar a fost de nerecunoscut folosind acest test.

Denumiri de specii a

Pentru a determina legătura tulpinilor la nivel genetic, am secvențiat întreaga genă ARNr 16S din fiecare tulpină. Analiza noastră (Fig.4) a arătat că plusul Lactipan a fost 99% identic cu tulpina B. subtilis PY79 (acces GenBank nr. AF142577). Atât Dalat, cât și Bactisubtil erau membri ai B. subgrupul cereus. Bactisubtil a fost conservat 99% cu Bacillus thuringiensis (D16281) și 98% identic cu Biosubtil "Dalat", în timp ce Biosubtil "Dalat" a fost 98% identic cu B. thuringiensis (D16281). Domuvar s-a dovedit a fi 95% omolog cu o altă tulpină probiotică, Enterogermina (AF142576). Subtyl nu a prezentat o omologie puternică cu nici o specie Bacilluss în GenBank.

Relația filogenetică a bacteriilor bacillusprobiotice. Este prezentată legătura dintre probioticele Bacillus comerciale bazate pe analiza ARNr 16S. Enterogermina și Biosubtil („Biosubtil“ Nha Trang ”) sunt probiotice Bacillus comerciale și au fost caracterizate în altă parte (4).

DISCUŢIE

Scopul acestui studiu a fost de a stabili identitatea bacteriilor Bacillus disponibile în probiotice comerciale din spori utilizate pentru consumul uman. La rândul său, acest lucru ar oferi un prim pas important și necesar în înțelegerea modului în care endosporii bacterieni ar putea servi drept „bacterii prietenoase” sau probiotice. Rezultatele noastre au fost oarecum neașteptate și s-au dovedit interesante, cu un singur produs comercial etichetat corect. Pentru acele produse comercializate sau produse în Europa, acest lucru este deosebit de îngrijorător, deoarece, ca aliment nou, probioticele trebuie să fie autorizate și să respecte reglementările Uniunii Europene (de exemplu, Regulamentul CE 258/97).

Am folosit atât analiza ARNr 16S, cât și teste biochimice pentru a stabili identitatea speciilor. Concluziile noastre finale sunt prezentate în tabelele 4 și 5. Lactipan plus este clar B. subtilis și este strâns legat de PY79. Tulpina PY79, derivată din tulpina de tip 168, este utilizată pe scară largă ca tulpină izogenică pentru analiza genetică a dezvoltării sporilor (20). Ceea ce surprinde cu acest produs comercial este că este etichetat ca Lactobacillus sporogenes. Nici Manualul lui Bergey, nici Lista aprobată a denumirilor bacteriene nu o menționează ca specie.

Statutul probioticelor Bacillus a

Ultimul probiotic pe care l-am examinat a fost Subtyl. Analiza ARNr 16S a acestei tulpini nu a arătat nicio omologie semnificativă cu nicio specie cunoscută de Bacillus și, de fapt, a fost atât de divergentă încât ar trebui considerată o specie nouă. A fost legată de B. cereus pe baza testelor biochimice, deși la nivel genetic și biochimic, această specie a fost cea mai diferită de speciile Bacillus existente. Credem că ar trebui considerată o specie nouă și propunem numele de Bacillus vietnami. O altă caracteristică notabilă a acestei tulpini a fost nivelul ridicat de rezistență la penicilină și ampicilină. Este curios faptul că ambele probiotice vietnameze ar trebui să prezinte un nivel atât de ridicat de rezistență la aceste antibiotice și este îngrijorător faptul că în sud-estul Asiei, unde utilizarea răspândită a antibioticelor este răspândită, bacteriile rezistente la ampicilină și penicilină sunt consumate zilnic.

În concluzie, deși obiectivul nostru inițial de a caracteriza probioticele din spori a fost atins, am relevat, de asemenea, starea slabă a clasificării speciilor care se aplică în acordarea de licențe pentru produse pentru consum uman (Tabelul 5). Într-un studiu anterior am constatat că alte două probiotice sunt etichetate greșit (4) și, așa cum sa subliniat anterior, acest lucru ar trebui considerat o problemă de sănătate publică (5, 6). Faptul că unele dintre aceste specii prezintă niveluri ridicate de rezistență la medicamente este de o preocupare deosebită. Nu ne este clar cum sporii pot exercita un efect benefic pentru bacterioterapia orală. S-a constatat că o singură tulpină, Biosubtil "Dalat", susține creșterea anerobă, astfel încât, în principiu, sporii acestei tulpini ar putea germina și coloniza intestinul, așa cum sa sugerat anterior (8). Cu toate acestea, faptul că celelalte tulpini erau aerobe sugerează un alt mecanism de acțiune a acestora.

MULȚUMIRI

Mulțumim unității de microscopie electronică de la Universitatea Royal Holloway din Londra pentru asistență la microscopia electronică.