Weijie Yi

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Colegiul Medical Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

polifenoli

2 MOE Key Lab of Environment and Health, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

3 Departamentul de nutriție și igienă alimentară, Școala de sănătate publică și management, Universitatea medicală Binzhou, Yantai 264003, China

Xiao Xie

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Tongji Medical College, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

Miying Du

4 Departamentul de Management Hotelier, Universitatea de Turism, Guilin 541000, China

Yongjun Bu

5 Departamentul de nutriție și igienă alimentară, Universitatea de Medicină Xinxiang, Xinxiang 453000, China

Nannan Wu

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Colegiul Medical Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

Hui Yang

6 Spitalul Popular Kecheng, Quzhou 324000, China

Chong Tian

7 School of Nursing, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Fangyi Xu

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Colegiul Medical Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

Siyun Xiang

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Colegiul Medical Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

Piwei Zhang

8 Departamentul de Nutriție Clinică, Spitalul Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan, Hubei 430030, China

Zhuo Chen

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Colegiul Medical Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

Xuezhi Zuo

8 Departamentul de Nutriție Clinică, Spitalul Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan, Hubei 430030, China

Chenjiang Ying

1 Departamentul de Nutriție și Igienă Alimentară, Școala de Sănătate Publică, Colegiul Medical Tongji, Universitatea Huazhong de Știință și Tehnologie, Wuhan 430030, China

2 MOE Key Lab of Environment and Health, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Date asociate

Abstract

Domeniul de aplicare

Mai multe rapoarte din literatura de specialitate au sugerat efectele renoprotectoare ale corpurilor cetonice și ale polifenolilor de ceai verde (GTP). Studiul nostru anterior a constatat că consumul de GTP ar putea ridica expresia renală a enzimei ketogenice care limitează rata, care a fost redusă de o dietă bogată în grăsimi (HFD) la șobolani. Aici, am investigat dacă ketogeneza poate media renoprotecția prin GTP împotriva unui HFD.

Metode și rezultate

Șobolanii Wistar au fost hrăniți cu HFD standard sau cu sau fără GTP timp de 18 săptămâni. Nivelul de stres oxidativ renal, funcția renală, expresia renală și nivelurile de activitate ale 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintaza 2 (HMGCS2) și sirtuina 3 (SIRT3) mitocondriale. Stresul oxidativ renal crescut și pierderea funcției renale induse de HFD au fost ameliorate de GTP. Ketogeneza renală și nivelurile de exprimare și activitate SIRT3, care au fost reduse de HFD, au fost restaurate de GTP. In vitro, celulele HEK293 au fost transfectate cu expresia eucariotă plasmidă pcDNA HMGCS2. Tratamentul GTP ar putea regla în sus expresia HMGCS2 și SIRT3. Deși expresia SIRT3 nu a fost afectată de transfecția HMGCS2, nivelul 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) și raportul acetil-MnSOD (K122)/MnSOD au fost reduse în celulele transfectate cu HMGCS2 în contextul H2O2.

Concluzie

Calea ketogeneză/SIRT3 mediază renoprotecția GTP-urilor împotriva stresului oxidativ indus de un HFD.

1. Introducere

Ketogeneza este declanșată în perioadele de exerciții fizice prelungite, post, restricție de calorii (CR) sau carbohidrați scăzuți și niveluri ridicate de consum de lipide. Recent, efectele pozitive ale cetogenezei au fost descrise în termeni de scădere în greutate [1], neuroprotecție [2, 3], hepatoprotecție [4] și renoprotecție [5-7]. Deși mecanismele precise ale acestor efecte sunt neclare, se consideră în mod obișnuit că promovarea cheltuielilor și echilibrului energetic și/sau reducerea speciilor reactive de oxigen (ROS) contribuie la aceste beneficii ale cetogenezei.

Studiile epidemiologice și experimentele pe animale au indicat că tiparele dietetice și componentele dietetice pot modula vascularizația și funcția renală [12, 13]. O dietă bogată în grăsimi pe termen lung (HFD) poate duce la stres oxidativ, fibroză și inflamații, inducând în cele din urmă leziuni renale funcționale și patologice [13]. În plus, obezitatea și anomalia metabolică, care sunt de obicei asociate cu un aport ridicat de grăsimi, duc la un risc mai mare de afectare renală [14]. În schimb, CR și fitochimicalele au fost verificate pentru a proteja rinichii împotriva stresului oxidativ [5]. Studiile noastre anterioare au stabilit că expresia HMGCS2 a crescut la nivelul ficatului, dar a scăzut la rinichi în contextul unui HFD. Cu toate acestea, tratamentul cu polifenol al ceaiului verde (GTP) ar putea regla expresia renală a HMGCS2, care este un efect similar cu cel al foamei [8, 15]. Prin urmare, am presupus că, spre deosebire de CR, ketogeneza indusă de un HFD poate avea specificitate tisulară, iar insuficiența renală indusă de un HFD poate fi parțial cauzată de ketogeneza renală redusă. În plus, similar cu CR, tratamentul GTP ar putea proteja rinichii prin promovarea ketogenezei.

Sirtuina 3 mitocondrială (SIRT3), o histonă deacetilază dependentă de nicotinamidă adenină dinucleotidică, este asociată cu antioxidarea CR și poate îmbunătăți activitatea HMGCS2 prin deacetilare. KB-urile au fost verificate pentru a crește raportul NAD +/NADH în neuroni, crescând ulterior activitatea antioxidantă a SIRT3 [16]. Cu toate acestea, nu se știe dacă există un mecanism similar în rinichi. De fapt, SIRT3 este exprimat abundent în rinichi și poate proteja celulele tubulare proximale de lipotoxicitatea indusă de palmitat prin îmbunătățirea capacității oxidative mitocondriale și a apărării antioxidante [17]. În plus, s-a raportat că GTP și epigalocatechina galat (EGCG, componenta principală a GTP) cresc expresia SIRT3 [18]. Pe baza faptelor de mai sus, am emis ipoteza că SIRT3 ar putea participa la renoprotecția ketogenezei. Prin urmare, studiul de față a investigat renoprotecția GTP împotriva unui HFD și rolul cetogenezei/SIRT3 în aceste procese.

2. Materiale și metode

2.1. Tratamente pentru animale

2.2. Cultura și tratamentele celulare

Celulele renale embrionare 293 (HEK 293) umane au fost obținute de la Banca de celule a Academiei de Științe din China (Shanghai, China). Celulele HEK293 au fost cultivate în mediul Eagle modificat (DMEM)/glucoză ridicată de Dulbecco conținând 10% ser fetal bovin și suplimentate cu penicilină/streptomicină în 5% CO2 la 37 ° C. Plasmidele au fost achiziționate de la Vigene Biosciences. După extracție și verificare, transfecția plasmidei pcDNA HMGCS2 a fost efectuată folosind reactivul de transfecție Lipofectamine 3000 conform instrucțiunilor producătorului. Celulele transfectate au fost tratate cu GTP (4 μg/ml, 24 de ore) sau H2O2 (0,1 mM, 6 ore) separat.

2.3. Reactivi

GTP-urile (91,21% catechine și 71,72% EGCG) au fost achiziționate de la Corona Science & Technology Development Co. Ltd. (Fu Zhou, China). Anticorpii policlonali de iepure (anti-MnSOD, anti-HMGCS2, anti-Nampt și anticatalază) au fost achiziționați de la Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, SUA). Anticorpii anti-FOXO3a și anti-SIRT3 provin de la Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, SUA). Anti-SOD2/MnSOD (acetil K122) și anticorpii anti-4-HNE au fost de la Abcam Inc. (Cambridge, Marea Britanie). Colesterolul total (TC), trigliceridele (TG), lipoproteinele cu densitate ridicată-colesterol (HDL-C), lipoproteinele cu densitate mică (LDL-C) și glicemia au fost detectate folosind kituri de la BioSino Bio-Technology & Science Inc . (Beijing, China). Kituri ELISA pentru măsurarea cantitativă a cistatinei serice C și a insulinei au fost de la Biovendor Inc. (Heidelberg, Germania) și Mercodia AB (Uppsala, Suedia). Kituri de testare a creatininei și N-acetil-β-D-glucozaminidazei (NAG) au fost achiziționate de la Institutul de Bioinginerie Nanjing Jiancheng (Jiangsu, China). DMEM/glucoză ridicată a fost achiziționat de la Gibco Inc. (New York, SUA). Reactivul de transfecție Lipofectamine 3000 a fost de la Invitrogen Inc. (California, SUA).

2.4. Testul de toleranță intraperitoneală la glucoză și testul de toleranță la insulină

Pentru IPGTT, șobolanii au postit timp de 12 ore și ulterior au primit o injecție intraperitoneală de glucoză (2 g/kg greutate corporală). Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute după injectare utilizând un glucometru (ACCU-CHEK Performa, Roche). Pentru ITT, șobolanii au fost injectați intraperitoneal cu insulină umană obișnuită recombinantă (0,8 U/kg greutate corporală) după post timp de 6 ore. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost monitorizate la 0, 30, 60, 90 și 120 de minute după injectare, folosind în continuare un glucometru. Aria de sub curbă a fost calculată prin însumare trapezoidală.

2.5. Analiza biochimiei serice

Probele de sânge au fost colectate după 30 de minute la temperatura camerei și apoi au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 10 minute pentru a separa serul. Glucoza serică, TG, TC, LDL-C, HDL-C și insulina au fost analizate folosind truse comerciale conform protocoalelor producătorilor.

2.6. Histologie și imunohistochimie

Pe scurt, secțiunile renale de parafină, cu grosime de aproximativ 3-4 μm, au fost colorate cu hematoxilină-eozină după ce au fost deparafinizate și rehidratate. Pentru colorarea imunohistochimică a rinichiului, secțiunile deparafinizate și rehidratate au fost blocate cu ser albumină bovină (BSA) după recuperarea antigenului și blocarea peroxidazei endogene și au fost apoi incubate cu anticorp 4-HNE la 4 ° C peste noapte. După incubarea cu anticorp secundar de capră anti-iepure marcat cu peroxidază de hrean (HRP-), secțiunile au fost colorate cu 3,3'-diaminobenzidină (DAB). Densitatea optică medie a fost analizată utilizând software-ul Image-Pro Plus.

2.7. Evaluarea funcției renale

În săptămânile 17 și 18, toate animalele au fost adăpostite individual în cuști metabolice pentru a colecta probe de urină de 24 de ore. Probele au fost centrifugate la 3000 × g timp de 10 minute pentru a îndepărta particulele în suspensie și apoi au fost depozitate în alicote la -80 ° C. Nivelurile de creatinină, activitatea NAG urinară și cistatina serică C au fost măsurate folosind teste enzimatice. Nivelurile de microalbumină urinară au fost măsurate folosind un analizor BioSystems A25 (BioSystems, Spania). Viteza de eliminare a creatininei (Ccr) a fost calculată utilizând următoarea formulă: Ccr (ml/h/100 g greutate corporală) = [creatinină urinară (mg/dl) × volum de urină (ml/h)]/[creatinină serică/dl ) × greutatea corporală (g)/100].

2.8. Analiza imunoblotării

Țesuturile cortexului renal au fost lizate cu tampon de testare radioimunoprecipitare (RIPA) (Beyotime, Shanghai, China), iar proteinele au fost cuantificate utilizând metoda acidului bicinchoninic (BCA) (Beyotime, Shanghai, China). Lizatele de proteine ​​(10-50 μg) au fost electroforizate pe geluri SDS-poliacrilamidă și au fost electrotransferate în membrane difluorură de poliviniliden (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, SUA). După blocare timp de 1 oră cu lapte degresat 10%, membranele au fost spălate și incubate cu anticorp primar peste noapte la 4 ° C, urmată de incubare cu al doilea anticorp conjugat HRP timp de 1 oră la temperatura camerei. Proteinele au fost apoi vizualizate utilizând reactivi ECL Western blotting (Millipore, Billerica, MA, SUA). GAPDH sau β-actina a servit ca un control intern.

2.9. Niveluri de activitate MnSOD, CAT, SOD total și Cu/Zn SOD și niveluri MDA, NAD și β-hidroxibutirat în cortexul și serul rinichi

Activitatea MnSOD, CAT, SOD total și Cu/Zn SOD și nivelurile de MDA în cortexul renal au fost analizate folosind truse comerciale conform instrucțiunilor producătorilor (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China).

Nivelurile de NAD (BioVision, San Francisco, SUA) și de β-hidroxibutirat (Cayman, Michigan, SUA) în cortexul și serul rinichi au fost detectate folosind truse comerciale conform instrucțiunilor producătorilor.

2.10. Analize statistice

tabelul 1

Efectele GTP asupra greutății și indicilor biochimici ai sângelui în diferite grupuri de șobolani (χ ± s, n ≥ 5).

CONCON + GTPsHFDHFD + GTPs
Greutatea inițială (g)195,00 ± 8,17192,50 ± 10,51193,80 ± 7,51192,80 ± 12,60
Greutatea finală (g)530,80 ± 16,65527,10 ± 24,50606,30 ± 24,18 ∗ 562,40 ± 55,02 #
Consumul de alimente (g/zi)27,05 ± 1,8427,66 ± 1,6820,62 ± 1,09 ∗ 20,96 ± 0,94
Aport de energie (kcal/zi)89,30 ± 6,2891,61 ± 5,6892,52 ± 5,1294,07 ± 4,26
Masa de grăsime viscerală (g)13,57 ± 0,8916,42 ± 4,8229,41 ± 8,66 ∗ 20,99 ± 6,43 #
Coeficientul de grăsime viscerală2,62 ± 0,253,14 ± 0,785,00 ± 1,24 ∗ 3,82 ± 0,99 #
Greutatea rinichilor (g)3,27 ± 0,533,22 ± 0,393,29 ± 0,332,98 ± 0,17
Coeficientul de rinichi0,63 ± 0,070,62 ± 0,060,56 ± 0,06 ∗ 0,55 ± 0,04
Glicemie (mmol/l)6,24 ± 0,526,24 ± 0,696,56 ± 0,585,57 ± 0,34 #
Trigliceridă (mmol/l)0,93 ± 0,370,74 ± 0,071,22 ± 0,220,92 ± 0,24 #
Colesterol total (mmol/l)1,63 ± 0,161,59 ± 0,351,99 ± 0,26 ∗ 1,49 ± 0,14 #
HDL-C (mmol/l)1,34 ± 0,281,30 ± 0,190,84 ± 0,26 ∗ 1,43 ± 0,14 #
LDL-C (mmol/l)0,29 ± 0,120,13 ± 0,08 ∗ 0,68 ± 0,11 ∗ 0,23 ± 0,12 #

3.2. Efectele GTP-urilor asupra IPGTT și ITT-ului șobolanilor

Rezistența la insulină este strâns legată de bolile renale cronice (CKD), iar nivelul insulinei poate perturba activitățile ketogene. Astfel, am măsurat sensibilitatea și concentrația serică a insulinei. Zona de sub curba IPGTT a fost mai mare în grupul HFD decât în ​​grupul vehiculului (P 1 (a) și 1 (b)). În plus, după injecția de insulină intraperitoneală, nivelurile serice de glucoză la 30 și 60 de minute au fost mult mai mari în grupul HFD decât în ​​grupul CON (Figura 1 (c)). HFD a crescut concentrația serică de insulină, care părea să fie redusă prin tratamentul cu GTP, deși diferența nu a fost semnificativă statistic (Figura 1 (d)).