Reprezentarea grafică a nivelurilor de CA-125 pe parcursul bolii/cursului de tratament al pacientului diagnosticat cu HGSOC. Se evidențiază cele două puncte de timp, la D-LPS (pre-NACT) și la IDS (post-NACT), în care au fost colectate probe de sânge și de țesut tumoral ovarian. CA-125: antigenul cancerului 125; D -LPS: laparoscopie diagnostic; NACT: chimioterapie neoadjuvantă; IDS: intervenție chirurgicală intermitentă; HGSOC: cancer ovarian seros de înaltă calitate.

celule

Reprezentarea grafică a VAF observată pentru SNV în TP53 identificată de NGS în probe de sânge (referință) și de țesut tumoral, colectate la pre-terapie (pre-NACT) la D-LPS și post-terapie (post-NACT) la IDS, de la un pacient cu HGSOC. (a) Graficul cu bare arată scăderea VAF în probele de tumori pre- (27,71%) și post-NACT (4,21%), indicând prevalența alelei WT „C” (bara albastră) comparativ cu bara alelei Alt „G”) la IDS pentru TP53 c.215C> G (p.P72R) SNP, prezent în heterozigoză (57,31%) în proba de referință de sânge; (b) Graficul cu bare arată creșterea VAF în probele tumorale pre- (50,13%) și post-NACT (94,33%), evidențiind prevalența alelei Alt „A” (bara roșie) comparativ cu alela WT „G” (bara verde) ) în proba de țesut HGSOC colectată la IDS de TP53 c.375 + 1G> O mutație, absentă în proba de referință a sângelui (numai alela WT „G”, bară verde). VAF: varianta de frecvență alelă; NACT: chimioterapie neoadjuvantă; HGSOC: cancer ovarian seros de înaltă calitate; D-LPS: laparoscopie diagnostic; IDS: intervenție chirurgicală intermitentă; Alt: alternativă; WT: de tip sălbatic.

Electroferograme Sanger confirmative ale variantelor TP53 identificate de NGS la un pacient cu HGSOC, în probe tumorale colectate la D-LPS (pre-NACT) și la IDS (post-NACT) și în referință (linia germinativă) probă de sânge. (a) Rezultatul secvențierii în proba de sânge de referință care arată polimorfismul TP53 c.215C> G în heterozigoză (cutie albastră) și alela WT „G” în poziția TP53 c.375 + 1G> G (cutia neagră); (b) Rezultatul secvențierii în proba tumorală colectată la D-LPS (pre-NACT) a polimorfismului TP53 c.215C> G (vârf crescut pentru alela WT „C”, cutie albastră) și mutație TP53 c.375 + 1G > A (heterozigoză, cutie roșie), în configurație trans; (c) Rezultatul secvențializării probei tumorale colectate la IDS (post-NACT) a polimorfismului TP53 c.215C> G indicând homozigoza alelei WT „C” sau pierderea alelei Alt „G” (casetă albastră) și mutație TP53 c.375 + 1G> A care indică homozigoza alelei mutate Alt „A” sau pierderea alelei WT „G” (casetă roșie), în configurație trans. HGSOC: cancer ovarian seros de înaltă calitate; D-LPS: laparoscopie diagnostic; IDS: intervenție chirurgicală intermitentă; NACT: chimioterapie neoadjuvantă; SNP: polimorfism unic nucleotidic; NGS: secvențierea de nouă generație; WT: de tip sălbatic.

Model reprezentativ al SNV-urilor TP53 duble în configurație trans identificate în proba HGSOC pre-NACT/chemo-naivă la D-LPS, cu expansiune clonă și LOH somatică în proba tumorală post-NACT colectată la IDS. În celulele normale (sânge) la nivelul liniei germinale, a fost detectat doar TP53 SNP c.215C> G; în proba chimio-naivă/netratată (Tumoră pre-NACT), mutația splice TP53 c.375 + 1G> A a fost prezentă cu alela Alt minoră în trans la alela WT a polimorfismului TP53 c.215C> G; în eșantionul post-terapie/tratat (tumoră post-NACT), s-a observat expansiunea completă a clonei cu LOH somatic cu pierderea alelei minore Alt pentru TP53 c.215C> G SNP și pierderea alelei WT pentru TP53 c.375 + 1G> O mutație. Alela altă a mutației TP53 c.375 + 1G> A este reprezentată în roșu, WT de referință în verde; Alela altă a polimorfismului TP53 c.215C> G este colorată în portocaliu, alela de referință WT în albastru; alelele minore Alt sunt cu litere mici, alelele WT sunt cu litere mari. VAF: varianta de frecvență alelă; NACT: chimioterapie neoadjuvantă; HGSOC: cancer ovarian seros de înaltă calitate; D-LPS: laparoscopie diagnostic; IDS: intervenție chirurgicală intermitentă; Alt: alternativă; WT: de tip sălbatic; LOH: pierderea heterozigozității.

Hematoxilină și eozină (mărire H&E, 5 ×, 10 × și 20 ×) a secțiunilor HGSOC colectate la D-LPS (pre-NACT) și la IDS (post-NACT) și colorare imunohistochimică pentru p53 (10 ×, 20 × și 40 × mărire). (a - c) H&E a țesutului tumoral fixat în bouin, încorporat în parafină, colectat la D-LPS care arată arhitectura seroasă a carcinomului ovarian al cazului HGSOC cu mutație somatică în TP53 (a: 5 ×; b: 10 ×; c: 20 × ); (d - f) Expresia absentă (-) nucleară p53 pe țesutul tumoral colectat la D-LPS din cazul HGSOC cu mutație somatică în TP53 (d: 10 ×; e: 20 ×; f: 40 ×); (g - i) H&E a țesutului tumoral fixat în formalină, încorporat în parafină, colectat la IDS care arată arhitectura seroasă a carcinomului ovarian al cazului HGSOC cu mutație somatică în TP53 (g: 5 ×; h: 10 ×; i: 20 ×); (l - n) Expresia absentă (-) nucleară p53 pe țesutul tumoral colectată la IDS din cazul HGSOC cu mutație somatică în TP53 (l: 10 ×; m: 20 ×; n: 40 ×). Nu s-a observat nici o colorare citoplasmatică. NACT: chimioterapie neoadjuvantă; HGSOC: cancer ovarian seros de înaltă calitate; D-LPS: laparoscopie diagnostic; IDS: intervenție chirurgicală intermitentă.

Colorare imunohistochimică pentru secțiunile BRCA1, p16, WT1 și Ki-67 din secțiunile HGSOC colectate la D-LPS de la un pacient diagnosticat cu HGSOC, înainte de NACT (mărire 20 × și 40 ×). (a, b) Colorare nucleară pozitivă pentru BRCA1 observată în

95% din celulele tumorale (a: 20 ×, b: 40 ×); (c, d) Colorarea nucleară difuză și citoplasmatică a p16 prezentată de

95% din celulele tumorale (c: 20 ×, d: 40 ×); (e, f) Colorarea nucleară și citoplasmatică pentru WT1 observată în

70% din celulele tumorale (e: 20 ×, f: 40 ×); (g, h) colorare nucleară difuză a Ki-67 observată în

95% din celulele tumorale (g: 20 ×, h: 40 ×). NACT: chimioterapie neoadjuvantă; HGSOC: cancer ovarian seros de înaltă calitate; D -LPS: laparoscopie diagnostic; BRCA1: repararea ADN-ului BRCA1 asociat; WT1: tumora Wilms 1.

Abstract

1. Introducere

2. Materiale și metode

2.1. Colectarea probelor și etica umană

2.2. Analiza secvențierii de generație următoare și analiza LOH somatică

2.3. Secvențierea Sanger pentru validarea SN53-urilor TP53 în configurația Trans

2.4. Imunohistochimie

3. Rezultate

3.1. Istoricul cazului

2300 ml), ovariectomie dreaptă, omentectomie parțială și colectarea de biopsii multiple. Apoi, a fost recomandat NACT. Diagnosticul patologic a fost slab diferențiat (gradul tumoral G3) adenocarcinom ovarian infiltrat (pT3cNx) din subtipul seros, iar pacientul a fost repartizat în etapa IV FIGO pentru prezența revărsării pleurale distale. Nivelul CA-125 (valoarea normală este 2), datorită răspunsului clinic slab la platină pe baza criteriilor de evaluare a răspunsului în tumorile solide (RECIST) a scanării tomografiei computerizate (CT) și a nivelului CA-125, încă ridicat (239,0 U/mL ). După un total de zece cicluri, răspunsul chimioterapeutic a fost doar parțial cu normalizarea nivelului CA-125, dar cu tomografie cu emisie de pozitroni (PET)/tomografie care a evidențiat în continuare noduli peritoneali multipli și revărsat pleural. Conform Institutului Național al Cancerului - Criteriile comune de toxicitate versiunea 2.0 (NCI-CTC v. 2.0), pacientul a prezentat neutropenie de grad G4 după ciclul 5, 7 și 9, alopecie G1 și G2 după ciclul 5 și respectiv 6 și Oboseala G1 după cel de-al 9-lea ciclu. Neurotoxicitatea nu a fost raportată. Chirurgia (IDS) a fost apoi încercată cu histerectomie, ovariectomie stângă, apendectomie și rezecție intestinală parțială pentru prezența nodulilor peritoneali și mezenterici (RD).

3.2. Analiza moleculară prin NGS

3.3. Validarea rezultatelor NGS prin secvențierea Sanger

3.4. LOH somatic

3.5. Evaluarea imunohistochimică a expresiei p53 în probe tumorale HGSOC

95% din celulele tumorale cu

20% din celule cu slab (+),

55% cu moderat (++) și

20% cu intensitate mare (+++) (Figura 6c, d). Colorarea nucleară și citoplasmatică pentru proteina WT1 a fost expusă în

70% din celulele tumorale: intensitate slabă (+) a fost observată în citoplasmă în timp ce colorarea nucleară a arătat

20% din celule cu slab (+),

20% cu moderat (++) și

30% cu intensitate mare (+++) (Figura 6e, f). Procentul de nuclei tumorali Ki-67 pozitivi (indicele de proliferare Ki-67) [34] a fost

20% din celule cu slab (+),

40% cu moderat (++) și

35% cu intensitate mare de colorare (++) (Figura 6g, h).