M.V. Barbolina, R.S. Phillips, P.D. Gollnick, N.G. Faleev, TV Demidkina, Citrobacter freundii tirozin fenol-liază: rolul asparaginei 185 în modularea funcției enzimei prin stabilizarea unui intermediar chinonoid, Ingineria, proiectarea și selecția proteinelor, volumul 13, numărul 3, martie 2000, paginile 207-215, https: // doi.org/10.1093/protein/13.3.207

fenol-liază

Abstract

Introducere

Mecanismul general acceptat al catalizei TPL este prezentat în Schema 1.

Materiale și metode

Materiale

Lactatul dehidrogenază din mușchiul de iepure, piridoxal-P și NADH au fost achiziționate de la United States Biochemical (USB), la fel ca 1-tirozină, S-benzil-1-cisteină și S-etil-1-cisteină. De la Sigma s-au obținut β-clor-1-alanină, 1-fenilalanină, 1-metionină, acid 1-aspartic și 1-homoserină. S-metil-1-cisteina a fost un produs al ICN Biochemical. S- (o-nitrofenil) -1-cisteina (SOPC) a fost preparată așa cum s-a descris anterior (Phillips și colab., 1989). 3-Fluoro-1-tirozina a fost preparată prin sinteză enzimatică (Phillips și colab., 1990). [α- 2 H] -3-Fluoro-1-tirozină a fost realizată prin efectuarea sintezei enzimatice în 2 H2O așa cum a fost descris anterior pentru l-tirozină (Kilk și Phillips, 1988). [α, β, β- 2 H3] -3-Fluoro-1-tirozină a fost preparată așa cum a fost descris de Faleev și colab. (1996).

Pregătirea N185A TPL

Mutageneza specifică site-ului direcționată de oligonucleotide a fost realizată cu utilizarea plasmidei pTZTPL, care conține gena tpl de la C.freundii în pTZ18U (US Biochemical) (Antson și colab., 1993). ADN monocatenar a fost preparat cu ajutorul fagului auxiliar M13K07 (Vieira și Messing, 1987). Mutageneza dirijată la locul de desfășurare a fost efectuată prin metoda lui Taylor și colab. (1985) folosind trusa de mutageneză Sculptor in vitro de la Amersham. Pentru a efectua înlocuirea necesară Asn185 - Ala s-a pregătit oligonucleotida mutagenetică 5'-AGTCACGGTTGCCCTCGCAGGCGG-3. Plasmidele rezultate au fost examinate prin secvențierea dideoxi (Sanger și colab., 1977) în regiunea de mutație folosind Sequenază (US Biochemical.) Și un primer complementar nucleotidelor 1050-1073 din secvența genică tpl definită de Antson și colab. (1993). Plasmida care poartă schimbarea N185A a fost desemnată pTZTPL N185A. Celulele Escherichia coli SVS370 au fost utilizate ca gazdă pentru plasmidă. Celulele au fost crescute și enzima a fost purificată așa cum s-a descris anterior (Chen și colab., 1995b). TPL de tip sălbatic a fost purificat din celule E.coli SVS370 care conțin plasmida pTZTPL prin același procedeu.

Analize enzimatice

Activitatea enzimatică a fost măsurată în mod obișnuit cu S- (o-nitrofenil) -1-cisteină 0,6 mM (SOPC) în fosfat de potasiu 50 mM, pH 8,0, la 25 ° C (Phillips, 1987), urmând scăderea absorbției la 370 nm = ε = –1,86 × 10 3 l/mol.cm). O unitate de activitate a fost determinată ca cantitate de enzimă care catalizează transformarea a 1 μmol de SOPC pe minut.

Reacțiile de eliminare β au fost măsurate utilizând un test cuplat cu lactat dehidrogenază și NADH măsurat la 340 nm (Δε = –6,22 × 10 3 l/mol.cm), așa cum este descris de Morino și Snell (1970) pentru triptofanază. Amestecurile de reacție conțineau 50 mM fosfat de potasiu, pH 8,0, 50 μM piridoxal-P, 0,2 mM NADH, 0,02 mg lactat dehidrogenază și diferite cantități de substrat de aminoacizi într-un volum total de 0,6 ml, la 25 ° C. Reacția a fost inițiată prin adăugarea unei soluții de enzime. Determinarea parametrilor cinetici pentru SOPC a fost efectuată la 25 ° C în 50 mM fosfat de potasiu, pH 8,0, 5 mM 2-mercaptoetanol și 50 μM piridoxal-P, cu cantități variabile de SOPC și diluții adecvate de tip sălbatic și mutant TPL.

Efectele inhibitoare ale aminoacizilor asupra TPL mutant au fost determinate folosind SOPC ca substrat așa cum s-a descris mai sus.

Determinarea proteinelor

Proteina a fost determinată prin metoda lui Lowry și colab. (1951), utilizând albumina serică bovină ca standard. Concentrația TPL purificată a fost determinată din absorbanța la 278 nm (E 1% = 8,37) (Muro și colab., 1978), presupunând o masă moleculară subunitară de 51,4 kDa (Antson și colab., 1993).

Experimente de schimb de izotopi

Reacțiile de schimb de izotopi cu l-fenilalanină și l-metionină au fost efectuate în tampon fosfat de potasiu 50 mM în prezența piridoxal-P 0,1 mM într-un volum total de 4 ml. PH-ul soluției măsurat potențiometric cu un electrod de sticlă a fost egal cu 8,2, ceea ce corespunde p 2 H = 8,6 (Blesoe și Long, 1960). Concentrația de l-fenilalanină a fost de 28,6 mM, s-au adăugat 6,7 mg de [N185A] TPL și s-au retras alicote din amestecul de reacție după 1, 2, 3, 5 și 7 ore și s-au încălzit la 90 ° C timp de 5 minute pentru a opri reacție și apoi analizate prin 1H RMN. În reacția cu 1-metionină, concentrația acestuia din urmă a fost de 132 mM, s-au adăugat 3,34 mg de [N185A] TPL și s-au retras alicote după 5, 8, 26, 35 și 51 ore și s-au tratat ca mai sus. Raportul dintre produsele deuterate și nedeuterate a fost calculat din intensitățile relative relative ale semnalelor grupului α-proton și β-CH2, acesta din urmă fiind utilizat ca standard intern.

Măsurători ale debitului oprit

Înainte de efectuarea experimentelor cinetice rapide, enzima mamă a fost incubată cu piridoxal-P 1 mM timp de 1 oră la 30 ° C la pH 7,0 și apoi separată de piridoxal-P în exces folosind o coloană scurtă de desalinizare (PD-10, Pharmacia) echilibrată cu S-a măsurat 50 mM fosfat de potasiu, pH 8,6 și activitatea preparatului. Nu a fost observată nicio pierdere de activitate. Datele cinetice cu flux oprit de scanare rapidă au fost obținute cu un instrument RSM de la OLIS. Acest instrument are un timp mort de

2 ms și este capabil să colecteze spectre în regiunea vizibilă de la 300 la 600 nm la 1 kHz. Soluțiile enzimatice în fosfat de potasiu 50 mM, pH 8,6, au fost amestecate cu diferite concentrații de aminoacizi și s-au urmat modificări de absorbanță la 500 nm. Constantele de viteză au fost evaluate prin ajustarea exponențială utilizând programele LMFT sau SIFIT furnizate de OLIS. Validitatea montajului a fost evaluată prin deviația standard sau prin parametrul Durbin - Watson. De obicei, constantele de rată au fost estimate la o deviație standard de (Strickland și colab., 1975), folosind Enzfitter (Elsievier), unde kf și kr sunt constantele de rată înainte și inversă, respectiv.

unde Kp este afinitatea enzimei pentru produsul deuterat și [S] 0 este concentrația inițială a substratului.

Tratamentul tradițional al datelor (Foster și Niemann, 1953) a fost aplicat pentru a obține ratele inițiale din perioada de concentrare a produsului.

Rezultate

Studii cinetice la starea de echilibru pe [N185A] TPL

Dependențe de concentrație ale ratelor inițiale pentru reacțiile [N185A] TPL cu l-tirozină, 3-fluor-l-tirozină, S-metil-l-cisteină, S-etil-l-cisteină, S-benzil-l-cisteină, SOPC și β-cloro-l-alanina au respectat ecuația Michaelis - Menten și parametrii cinetici principali pentru aceste reacții sunt prezentați în Tabelul I .

Pentru a estima semnificația relativă a principalelor etape elementare în reacțiile cu substraturi adecvate, am folosit efecte izotopice cinetice multiple (KIE), deoarece fiecare etapă este susceptibilă la un KIE diferit. Pentru a determina α-KIE, la care deprotonarea aldiminei externe este sensibilă, am comparat reacțiile 3-fluoro-l-tirozinei și analogul său α-deuterizat în apă. Stadiul β-eliminării este sensibil la β-KIE. Pentru a evalua acest efect, s-au comparat reacțiile 3-fluoro-1-tirozinei și 3-fluoro- [β, β- 2 H2] -1-tirozinei. KIE-urile cu solvent, care sunt caracteristice pentru etapa de tautomerizare a fragmentului fenol, au fost determinate prin compararea reacțiilor de l-tirozină în apă și 2 H2O. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul II .

Au fost studiate efectele inhibitoare ale unor aminoacizi caracteristici asupra reacției [N185A] TPL cu SOPC. În toate cazurile, modelul de inhibiție a fost descris de o schemă de inhibiție competitivă reversibilă, iar valorile calculate ale Ki sunt prezentate în Tabelul III .

Schimbul catalizat enzimatic al α-protonului de l-fenilalanină și l-metionină în 2 H2O a fost examinat la concentrații mari de aminoacizi care au fost de 10 ori mai mari decât valorile Ki determinate pentru l-fenilalanină și l - metionină în experimentele la starea de echilibru. Astfel, ratele inițiale au fost considerate a fi apropiate de Vmax și au fost calculate valorile kcat respective, desemnate kexch. Aceste date sunt comparate în tabelul IV cu ratele respective de deprotonare și reprotonare.

Studii cinetice rapide cu aminoacizi

3-Fluoro-1-tirozină.

Interacțiunea [N185A] TPL cu 3-fluoro-1-tirozină a fost caracterizată printr-o scădere a absorbției interne a aldiminei (λ = 420 nm) și apariția unor specii noi care se absorb la 345 și 500 nm (Figura 1). Prima absorbanță, care a apărut mai rapid, poate fi atribuită unei structuri gem-diamine, iar a doua aparține în mod evident intermediarului chinonoid. A fost posibil să se urmeze cursul timpului pentru formarea gem-diaminei, care a fost descris în mod satisfăcător printr-un singur proces exponențial. Dependența știuleților de concentrația de 3-fluor-l-tirozină (Figura 2) a fost adaptată prin Ecuația 5, astfel modelul de reacție respectă Schema cinetică 2 și parametrii cinetici respectivi pentru formarea gem-diaminei sunt prezentați în Tabelul V. Curbele cinetice pentru formarea chinonoidelor au fost adaptate printr-un proces exponențial. Constantele de viteză (kobs) nu au depins de concentrația substratului. Valoarea medie a fost estimată la 50,9 ± 2,6 s –1. Dependența de concentrație a amplitudinii absorbantei la 500 nm a fost bine descrisă printr-o ecuație formal analogă cu ecuația Michaelis - Menten. Valoarea Ks = 0,9 ± 0,08 mM a fost determinată din aceste date și este în acord cu valoarea de Km = 0,78 mM găsită în experimentele la starea de echilibru.

l-metionina. Scăderea absorbției aldiminei interne și apariția intermediarului chinonoid (λ = 500 nm) cu un punct izosbestic clar a fost observată pentru reacția [N185A] TPL cu l-metionină. Spre deosebire de reacțiile cu 3-fluor-l-tirosină și l-fenilalanină, nu au fost detectate specii care absorb la 340-350 nm. Curbele cinetice pentru formarea chinonoidelor au fost descrise printr-un singur proces exponențial. Dependența de concentrație a știuleților (Figura 4) este de acord cu schema cinetică 2. Parametrii cinetici respectivi determinați prin potrivirea datelor la ecuația 5 sunt prezentați în Tabelul IV. Constanta de legare calculată prin ecuația 7, 7,9 mM, a fost mai mică decât Ki = 13,2 mM (Tabelul III) determinată în experimentele de inhibare la starea de echilibru. Din dependența de concentrație a amplitudinii absorbantei la 500 nm, s-a găsit Ks = 7,9 ± 0,9 mM.

Discuţie

Spectrele de absorbție și dicroism circular ale holoenzimei N185A TPL obținute (date neprezentate) au fost similare cu cele ale enzimei de tip sălbatic cu benzi caracteristice la 425 și 342 nm aparținând tautomerilor cetoenaminici și enoliminici ai aldiminei interne (Bazhulina, NP, Mozozov, YV, Papisova, AI, Dimidkina, TV, Eur. J. Biochem., Acceptat). Similitudinea formei, poziției și coeficienților de extincție molară a absorbției și a benzilor de dicroism circular ale aldiminelor interne ale enzimelor mutante și de tip sălbatic sugerează că înlocuirea N185 cu Ala nu are ca rezultat nicio modificare structurală semnificativă a piridoxal-P- site de legare. Astfel, diferențele în proprietățile funcționale dintre TPL de tip sălbatic și mutant pot fi interpretate ca o consecință a efectului mutației asupra etapelor elementare separate în cadrul mecanismului general prezentat în Schema 1.

Efectul mutației asupra legării TPL cu substraturi și inhibitori

Pentru a evalua rolul Asn185 asupra afinității enzimei pentru aminoacizi am examinat relația dintre structura diferiților aminoacizi și eficiența legării lor la TPL mutant ca inhibitori competitivi reversibili. Pentru TPL de tip sălbatic s-a stabilit (Faleev și colab. 1988) că pentru un număr de aminoacizi care poartă substituenți neramificați fără grupări funcționale, hidrofobicitatea lanțului lateral este principalul factor care controlează Ki. Aminoacizii care conțin lanțuri laterale nucleofile prezintă afinități sporite pentru enzimă. S-a presupus că acești substituenți nucleofili interacționează cu o grupare electrofilă în situsul activ. Dovezile au fost prezentate de Mouratou și colab. (1999) că Arg100 ocupă o poziție adecvată pentru a efectua o astfel de interacțiune. În lucrarea de față am determinat valorile Ki pentru reprezentanții caracteristici ai ambelor grupuri de aminoacizi pentru mutantul TPL N185A. Aceste date sunt prezentate în Tabelul III și Figura 6. Este evident (Figura 6) că pentru aminoacizii neramificați există o relație liniară cu o pantă de

1 între valorile –RTlnKi pentru TPL-uri mutante și de tip sălbatic:

Astfel, pentru inhibitorii de aminoacizi neramificați, hidrofobicitatea lanțului lateral rămâne parametrul principal care controlează Ki atunci când Asn185 este înlocuit cu Ala. Valorile afinității absolute sunt reduse pentru mutant cu o medie de 0,69 ± 0,35 kcal/mol. Pe de altă parte, se poate observa (Figura 6) că pentru majoritatea aminoacizilor aparținând celui de-al doilea grup de inhibitori, afinitățile pentru enzima mutantă sunt mult mai scăzute și punctele respective prezintă abateri negative mari de la linia dreaptă. Pentru majoritatea substraturilor testate, afinitățile sunt, de asemenea, scăzute considerabil mai mult (de la 1,55 la 0,9 kcal/mol) la compararea mutantului cu TPL sălbatic, după cum se poate calcula din valorile Km prezentate în Tabelul I .

Efectul mutației și distribuția intermediarilor

Labilitatea α-protonului în complexele TPL cu aminoacizi și ratele schimbului de izotop α-proton catalizat de TPL în 2 H2O

Atât TPL-urile de tip sălbatic, cât și cele [N185A] catalizează schimbul de izotopi al protonilor α ai unor aminoacizi pentru deuteriu în 2 H2O. Am comparat ratele de schimb observate cu parametrii cinetici pentru formarea chinonoidelor pentru reacții de tip sălbatic și TPL N185A cu l-fenilalanină și l-metionină. Aceste date sunt prezentate în Tabelul IV. Interesant, pentru reacțiile enzimei mutante cu ambii inhibitori, scăderea constantei de echilibru pentru deprotonare (Kq = kf/kr) rezultă numai din accelerarea reacției de reprotonare. Ratele de deprotonare nu scad, așa cum s-ar putea aștepta, ci cresc de fapt, iar în cazul l-metioninei cresc considerabil (cu un factor de 5,7). Acest lucru poate fi explicat printr-o schimbare conformațională care apare în enzima mutantă, care asigură o orientare relativă mai favorabilă între α-protonul din aldimina externă și grupul de bază care acceptă acest proton.

Studii sistematice ale mecanismului schimbului de protoni C-α în reacțiile TPL cu un număr de aminoacizi sunt în curs de desfășurare.

Efectul mutației asupra reactivității substraturilor și mecanismului de reacție

Datele cinetice care caracterizează reacțiile TPL N185A cu diverse substraturi sunt prezentate în Tabelul I în comparație cu datele analoage pentru enzima de tip sălbatic. În general, valori de Km mai mari se găsesc pentru TPL mutant decât pentru enzima de tip sălbatic cu aceleași substraturi. Acest lucru este de așteptat luând în considerare destabilizarea intermediarului chinonoid și, eventual, a aldiminei externe, cauzată de mutație.