• Abstract
  • Sfat de bază
  • Repere ale articolului
  • Articol complet (PDF)
  • Articol complet (HTML)
  • Audio
  • PubMed Central
  • PubMed
  • CrossRef
  • Google Scholar
  • Articole similare (135)
  • Cronologia proceselor de publicare a articolelor (7)
  • Evaluarea autorilor (1)
  • Urmărirea calității articolului (0)

  • Articol complet (HTML) (79)
  • Articol complet (PDF) (28)

Obezitatea este un factor de risc major pentru o varietate de boli, cum ar fi diabetul, boala hepatică grasă nealcoolică și bolile cardiovasculare. Restricționarea aportului de energie sau restricția calorică (CR) poate reduce greutatea corporală și poate îmbunătăți parametrii metabolici la pacienții supraponderali sau obezi. Am constatat anterior că decoctul Lingguizhugan (LZD) în combinație cu CR poate reduce în mod eficient nivelurile lipidelor plasmatice la pacienții cu sindrom metabolic. Cu toate acestea, mecanismul care stă la baza tratamentului CR și LZD este încă neclar.

decoctul

Pentru a investiga dacă CR și LZD îmbunătățesc parametrii metabolici prin modularea microbiotei intestinale.

Am extras componentele solubile în apă din materii prime și le-am uscat ca extracte LZD. Șoarecii C57BL/6 de sex masculin în vârstă de opt săptămâni au fost tratați cu un regim de tratament 3-d, care a inclus 24 de ore post, urmat de extragerea extractelor LZD timp de 2 zile consecutive, urmată de o dietă normală (ND) ad libitum timp de 16 săptămâni Pentru a testa efectele microbiotei intestinale asupra obezității induse de dietă, șoarecii C57BL/6 de sex masculin de 8 săptămâni au primit transplant de microbiotă fecală (FMT) de la șoareci tratați cu CR și LZD la fiecare 3 zile și au fost hrăniți cu dietă bogată în grăsimi (HFD) ad libitum timp de 16 săptămâni Șoarecii martori au primit fie gavaj salin sau FMT de la șoareci hrăniți cu ND care au primit gavaj salin așa cum s-a menționat mai sus. Greutatea corporală a fost monitorizată bi-săptămânal. Consumul de alimente pentru fiecare cușcă găzduind cinci șoareci a fost înregistrat săptămânal. Pentru a monitoriza glicemia, colesterolul total și trigliceridele totale, au fost recoltate probe de sânge prin intermediul sângerare submandibulară după 6 ore de post. Rata consumului de oxigen a fost monitorizată cu cuști metabolice. Fecalele au fost colectate și ADN-ul fecal a fost extras. Profilurile microbiotei intestinale au fost mapate prin secvențierea metagenomică.

Am constatat că tratamentul CR și LZD a redus semnificativ greutatea corporală a șoarecilor hrăniți cu ND (28,71 ± 0,29 vs. 28,05 ± 0,15, P Obezitate, diabet, metabolism lipidic, hepatosteatoză, microbiota intestinală

Tipul de bază: Acest studiu arată că restricția calorică (CR) împreună cu decoctul Lingguizhugan (LZD) reduc ușor greutatea corporală și nivelurile de glucoză din sânge ale șoarecilor alimentați cu dietă normală (ND). Cu toate acestea, transplantarea microbiotei fecale a acestor șoareci în șoareci alimentați cu conținut ridicat de grăsimi (HFD) alimentați cu obezitate indusă de dietă, steatoză hepatică și hiperglicemie. Mai mult, am constatat că transplantul de microbiote fecale crește rata de consum de oxigen a șoarecilor și suprimă biosinteza lipidelor hepatice. Folosind secvențierea metagenomică, am descoperit în continuare că tratamentul CR și LZD modifică profilul șoarecilor hrăniți cu ND, iar transplantul de microbiote fecale modifică modificările induse de HFD ale microbiotei intestinale. Luat împreună, studiul nostru evidențiază faptul că tratamentul CR și LZD își exercită efectele de îmbunătățire metabolică prin intermediul modulând microbiota intestinală.

  • Citare: Liu MT, Huang YJ, Zhang TY, Tan LB, Lu XF, Qin J. Lingguizhugan decoct atenuează obezitatea indusă de dietă și hepatosteatoza prin intermediul microbiota bună. World J Gastroenterol 2019; 25 (27): 3590-3606
  • URL:https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v25/i27/3590.htm
  • DOI:https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v25.i27.3590

În acest scop, am explorat mai întâi dacă CR în combinație cu LZD afectează metabolismul energetic și al lipidelor la șoareci fără nici o perturbare a metabolismului, adică șoarecii hrăniți cu o dietă normală (ND). Am constatat că tratamentul combinat al CR + LZD a redus greutatea corporală și nivelul glicemiei la șoarecii hrăniți cu ND. Pentru a clarifica în continuare dacă astfel de efecte au fost mediate de microbiotă, am transplantat microbiota fecală de la șoareci hrăniți ND tratați cu CR + LZD la șoareci alimentați cu dietă bogată în grăsimi (HFD) și am studiat efectele acesteia asupra parametrilor metabolici. Interesant, am constatat că transplantul de microbiote fecale (FMT) a protejat șoarecii de obezitatea indusă de dietă și hepatosteatoza și a scăzut nivelul lipidelor plasmatice prin promovarea oxidării acizilor grași (FA) și inhibarea biosintezei lipidelor hepatice. Studiul nostru evidențiază astfel un nou mecanism farmacologic al tratamentului combinat cu CR + LZD în tratarea obezității și MetS.

Pentru a colecta fecalele, șoarecii au fost adăpostiți individual în cuști regulate, fără nicio umplutură timp de 1-2 ore, iar fecalele au fost colectate manual și răcite imediat cu gheață până la utilizare. Pentru fiecare grup, s-a cântărit 1 g de fecale, s-a omogenizat cu 2,5 ml soluție salină tamponată cu fosfat sterilizat folosind un omogenizator cu microtub și s-a filtrat cu un filtru de celule de 40 μm (Thermo Scientific) pentru a îndepărta orice resturi mari. Omogenatele fecale preparate au fost depozitate pe gheață și utilizate în decurs de 2 ore. Pentru FMT, 200 μL omogenate fecale au fost date șoarecilor prin gavaj oral la fiecare 3 zile.

Cu o săptămână înainte de sfârșitul studiului, a fost efectuat un test de toleranță la glucoză intraperitoneal așa cum s-a descris anterior [15]. Pe scurt, după 16 ore de post, 2 g/kg glucoză a fost injectată intraperitoneal șoarecilor. Probele de sânge au fost colectate din coadă în zadar la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute după injectarea glucozei, iar nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu ajutorul unui glucometru (Johnson și Johnson). Nivelurile de glucoză au fost comparate la fiecare moment, iar diferențele generale în controlul glicemic au fost comparate folosind zona de sub curbă.

Activitatea metabolică și fizică a șoarecilor a fost măsurată folosind un calorimetru indirect cu circuit deschis (Oxylet, Panlab) [16]. Pe scurt, șoarecii au fost adăpostiți individual în camere metabolice, iar consumul de O2, producția de CO2 și activitatea fizică au fost înregistrate la intervale de 30 de minute timp de 60 de ore consecutive. Pentru precizie, datele înregistrate din primele 12 ore după ce șoarecii au fost adăpostiți în cameră nu au fost analizate. Coeficientul respirator (RQ) a fost calculat ca raport între producția de CO2 și consumul de O2.

Colorarea hematoxilinei și eozinei (H și E) și a roșii uleioase O (ORO) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Ref). Pe scurt, H și E au fost efectuate pe secțiuni hepatice de 5 μm care au fost fixate de Bouin și încorporate în parafină. Pentru colorarea ORO, care a fost utilizată pentru detectarea lipidelor neutre, țesuturile hepatice proaspete încorporate în compusul cu temperatură optimă de tăiere au fost criosecționate cu o grosime de 7 μm. După fixarea cu 4% paraformaldehidă, secțiunile au fost colorate cu 0,3% ORO urmând proceduri standard și contracolorate cu hematoxilină. Imaginile au fost scanate folosind cititorul multi-mod Cytation 5 Imaging Cell (BioTek Instruments, Statele Unite).

Pentru a măsura nivelurile plasmatice de ALT, AST, BUN și insulină, probele de sânge au fost colectate după 6 ore de post, la sfârșitul studiului și pre-curățate prin centrifugare la 3000 × g timp de 5 minute. Nivelurile de insulină au fost măsurate cu un kit ELISA de la ALPCO (catalog nr. 80-INSMSU-E01) conform protocolului producătorului. Activitățile plasmatice ALT și AST și nivelurile BUN au fost măsurate folosind un kit colorimetric de la Biosino (China), urmând protocolul standard al producătorului.

Pentru imunoblotare, probele de ficat de șoarece de 50 mg au fost omogenizate în tampon RIPA (Beyotime, China) cu un cocktail inhibitor de protează (Roche) folosind un TissueLyzer (Jingxin, China). Omogenatele au fost pre-curățate prin centrifugare la 10000 × g timp de 10 minute la 4 ° C. Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate utilizând testul BCA (Pierce). Cantități egale de proteine ​​(20-30 mg) au fost încărcate și separate pe 4% -12% geluri Bis-Tris (GenScript) și transferate în membranele PVDF folosind iBlot ® 2 Dry Blotting System (Thermo Fisher Scientific). Bloturile au fost apoi sondate cu următorii anticorpi: Anti-ACC (1: 1000, Cell Signaling Technology), anti-PPARγ (1: 1000, Proteintech), anti-SCD1 (1: 500, Abcam), anti-SREBP-1c (1: 1000, Proteintech), anti-FASN (1: 1000, Proteintech), anti-β-actină (1: 5000, Proteintech), anti-IgG de șoarece (1: 5000, Jackson ImmunoResearch), anti-iepure IgG 1: 5000, Jacson ImmunoResearch), și apoi detectat de Clarity ™ Western Substrat (Bio-Rad). Intensitățile benzilor au fost analizate folosind ImageJ.

Pentru a măsura conținutul de lipide din ficat, metoda Folch a fost utilizată pentru extragerea lipidelor hepatice [23]. Pe scurt, probele de ficat de 50 mg au fost omogenizate folosind TissueLyzer (60 Hz, 30 s) în amestec de cloroform și metanol (2: 1) urmat de adăugarea de metanol, cloroform și apă ultrapură. Lipidele extrase au fost uscate cu gaz N2 și dizolvate cu 200 uL PBS conținând 1% Triton X-100. Colesterolul și trigliceridele au fost măsurate folosind truse colorimetrice (Wako).

Secvențierea și analiza metagenomică au fost efectuate de Novagen (Beijing, China). Pe scurt, 40 mg de fecale de la fiecare șoarece au fost reunite și ADN-ul a fost extras folosind un extractor automat de ADN (Chemagic360, PelkinElmer). Concentrația ADN-ului a fost măsurată folosind Qubit ® dsDNA Assay Kit în Qubit ® 2.0 Fluorometer (Life Technologies, CA, Statele Unite), iar calitatea ADN-ului a fost verificată folosind Labchip GX Touch 24 și HT ADN range extins Labchip kit. Pentru construcția bibliotecii, a fost utilizat ca material de intrare 1 μg de ADN pe probă. Bibliotecile de secvențiere au fost generate folosind NEBNext ® Ultra ™ DNA Library Prep Kit pentru Illumina (NEB, Statele Unite), urmând recomandările producătorului. Au fost adăugate coduri index pentru a atribui secvențe fiecărui eșantion. Pe scurt, proba de ADN a fost fragmentată prin sonicare la o dimensiune de 350 bp, apoi fragmentele de ADN au fost lustruite la sfârșit, cu coadă A și ligate cu adaptorul de lungime completă pentru secvențierea Illumina cu amplificare PCR suplimentară. În cele din urmă, produsele PCR au fost purificate (sistemul AMPure XP), iar bibliotecile au fost analizate pentru distribuirea dimensiunilor de către Agilent2100 Bioanalyzer și cuantificate folosind PCR în timp real.

Pentru procesarea și analiza datelor, datele brute obținute de pe platforma de secvențiere Illumina HiSeq au fost preprocesate mai întâi folosind Readfq (versiunea 8, ht tps: //github.com/cjfields/readfq) pentru a obține date curate pentru analiza din aval. Criteriile pentru prelucrarea datelor brute au fost după cum urmează: (1) Citirile care conțin baze de calitate scăzută (valoarea implicită a pragului de calitate ≤ 38) peste o anumită porțiune (lungimea implicită de 40 bp) au fost eliminate; (2) Citirile în care baza N a atins un anumit procent (lungimea implicită de 10 bp) au fost eliminate; (3) Citirile care au partajat o suprapunere deasupra unei anumite porțiuni cu adaptorul (lungimea implicită de 15 bp) au fost eliminate. Datele curate obținute au fost ulterior aruncate în baza de date a gazdei (mouse-ului) folosind Bowtie (versiunea 2.2.4, http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) pentru a elimina orice gene care erau de origine gazdă. Pentru asamblarea metagenomilor din datele curate achiziționate, a fost utilizat software-ul SOAPdenovo (versiunea 2.04, http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html). Pentru predicția genelor și analiza abundenței, au fost utilizate MetaGeneMark (versiunea 2.10, http://topaz.gatech.edu/GeneMark) și CD-HIT (versiunea 4.5.8, http://www.bioinformatics.org/cd-hit) . Pentru predicția taxonomiei, DIAMOND (versiunea 0.9.9, https://github.com/bbuchfink/diamond), baza de date NR (versiunea 2018-01-02, https: // http: //www.ncbi.nlm.nih. gov), software-ul MEGAN, pachetul R vegan (versiunea 2.15.3) și software-ul LEfSe au fost utilizate. Parametrii detaliați utilizați în analiză sunt disponibili la cerere.

Toate valorile au fost prezentate ca medie ± SE. Pentru experimente cu n numărul ≥ 8/grup, iar testul omnibus D'Agostino-Pearson a fost efectuat pentru a testa normalitatea. Pentru experimente cu un inferior n numărul, a fost efectuat un test Kolmogorov-Smirnov pentru testul de normalitate. După trecerea testului de normalitate, ANOVA unidirecțională urmată de testul Bonferroni a fost efectuată pentru compararea a mai mult de două grupuri. Un student t-testul a fost utilizat pentru a compara diferențele dintre două grupuri. P valorile șoarecilor masculi C57BL/6J de opt săptămâni au primit tratament de control (roz) sau restricție calorică și decoct Lingguizhugan (CR + LZD) (verde) timp de 16 săptămâni; n = 10 per grup. A: Greutatea corporală a fost monitorizată bisăptămânal în timpul perioadei de studiu și fiecare punct și eroare reprezintă media ± eroarea standard; B: Consumul acumulat de alimente în perioada experimentală; C: Nivelurile glicemiei în jeun au fost măsurate în săptămânile 0 și 16; D: nivelurile plasmatice ale colesterolului total; E: niveluri totale de trigliceride plasmatice; F-H: activitate alamină plasmatică (ALT) și aspartat transaminază (AST) și raport AST/ALT; I: Nivelurile de azot din uree din sânge. Datele au fost evaluate pentru semnificația statistică prin testul t al elevului și sunt reprezentate după cum urmează: a P

Nu este clar dacă FMT a redus nivelul lipidelor hepatice numai prin creșterea oxidării lipidelor. Astfel, am măsurat expresia hepatică a genelor cheie implicate în biosinteza lipidelor. Am constatat că HFD a crescut expresia SREBP-1c, ACCα, FASN, SCD1 și PPARγ în ficat [24], comparativ cu nivelurile de expresie din ficatul șoarecilor hrăniți cu ND (Figura 4A-E). Astfel, expresia crescută a acestor gene lipogene explică creșterea depunerii de lipide în ficat și țesuturile adipoase. În mod curios, FMT de la șoareci tratați cu CR + LZD, dar nu de la șoareci martori, a redus expresia hepatică a acestor gene lipogene (Figura 4A-E). Mai mult, am măsurat abundența de proteine ​​a acestor factori cheie prin imunoblotare. În conformitate cu profilurile de expresie genică, proteinele SREBP-1c, ACCα, FASN, SCD-1 și PPARγ au fost toate reduse prin FMT (Figura 4F și G). Luate împreună, aceste date sugerează că FMT suprimă și biosinteza lipidelor în ficat, explicând în continuare observația că conținutul de lipide hepatice a fost redus de FMT.

Decoctul Lingguizhugan (LZD) în combinație cu restricția alimentară este utilizat pe scară largă în practica clinică pentru a trata pacienții cu tulburări metabolice, cum ar fi obezitatea, diabetul, nivelurile ridicate de lipide plasmatice și bolile hepatice grase nealcoolice. În ciuda aplicării și eficienței sale largi, se știe puțin despre mecanismul său.

Deși este bine acceptată utilizarea LZD într-o clinică pentru tratarea pacienților cu tulburări metabolice, lipsa cunoștințelor despre mecanismul său a limitat utilizarea acestuia. Clarificarea mecanismului farmacologic va oferi dovezi științifice privind utilizarea clinicii sale. Studii recente au arătat că medicamentele tradiționale din plante din China își exercită efectele prin modularea microbiotei intestinale, care a fost nerecunoscută anterior.

Pentru a investiga dacă LZD combinat cu restricția alimentară îmbunătățește parametrii metabolici prin intermediul modulând microbiota intestinală.

Pentru a răspunde la această întrebare, am administrat gavaj LZD în plus față de restricția alimentară la șoarecii hrăniți cu o dietă normală și am monitorizat greutatea corporală, glicemia și nivelul lipidelor plasmatice. În același timp, am colectat fecalele acestor șoareci și le-am omogenizat cu soluție salină. Am dat acestor omogenate fecale, care conțin microbi, șoarecilor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Deoarece o dietă bogată în grăsimi crește greutatea corporală, aceasta determină creșterea nivelului de lipide din plasmă și a nivelului de glucoză din sânge și induce acumularea anormală de lipide în ficat. Astfel, am studiat efectele administrării de omogenate fecale de la șoareci tratați cu LZD și restrânși cu alimente asupra anomaliilor metabolice induse de dietă.

Am constatat că LZD împreună cu restricția alimentară au redus ușor greutatea corporală și nivelurile de glucoză din sânge, dar nu au afectat nivelul lipidelor plasmatice. Cu toate acestea, oferirea omogenatului fecal colectat de la șoareci LZD și cu restricție alimentară a redus foarte mult greutatea corporală, nivelurile de lipide plasmatice, conținutul de lipide hepatice și nivelurile de glucoză din sânge ale șoarecilor pe o dietă bogată în grăsimi. De asemenea, am constatat că administrarea șoarecilor de omogenizați fecali a favorizat în mod semnificativ oxidarea grăsimilor și a inhibat sinteza grăsimilor. Folosind tehnici de secvențiere a ADN-ului, am constatat că LZD împreună cu restricția alimentară au schimbat semnificativ compoziția bacteriilor din intestin.

Am descoperit că o medicină tradițională chineză folosită pe scară largă poate schimba compoziția bacteriilor intestinului. Transferul acestor bacterii intestinale în șoareci hrăniți cu diete bogate în grăsimi poate reduce creșterea glucozei din sânge, a nivelului de lipide plasmatice, a conținutului de lipide hepatice și a creșterii în greutate corporală indusă de dietă. Astfel, microbii intestinali sunt ținta primară cea mai probabilă a LZD și a tratamentului de restricție alimentară.

Studiul nostru evidențiază posibilitatea utilizării bacteriilor pentru tratarea tulburărilor metabolice, cum ar fi obezitatea, în viitor. Folosind metagenomica, secvențierea metatranscriptomică și metabolomica fecală, este posibil să se identifice cele mai importante bacterii și metaboliți care stau la baza tratamentului LZD și al restricției alimentare. Acest lucru va face posibilă cultivarea bacteriilor identificate in vivo și tratați-le cu extracte LZD. Apoi, administrarea pacienților cu astfel de bacterii cultivate și tratate ar oferi efecte similare tratamentului cu LZD, reducând astfel orice potențial efect toxic al medicamentului pe bază de plante.

Autorii le mulțumesc membrilor laboratorului Dr. Xi-Feng Lu pentru asistența lor tehnică.

Sursa manuscrisului: manuscris nesolicitat

Tipul de specialitate: gastroenterologie și hepatologie

Țara de origine: China

Clasificarea raportului peer-review

Gradul A (excelent): A

Gradul B (Foarte bine): B

Gradul C (bun): C, C

P-Reviewer: Barzilay J, Hassan AI, Muriel P, Zhao JB S-Editor: Yan JP L-Editor: Filipodia E-Editor: Ma YJ