Francisco Verdeguer

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Meghan S. Soustek

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Maximilian Hatting

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

c Facultatea de Medicină, Universitatea RWTH Aachen, Aachen, Germania

Sharon M. Blättler

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Devin McDonald

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Joeva J. Barrow

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Pere Puigserver

un Departament de Biologie al Cancerului, Institutul Dana-Farber Cancer, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

b Departamentul de biologie celulară, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Abstract

INTRODUCERE

Recent, s-a demonstrat că factorii sistemici reglează termogeneza țesutului adipos maro și bej, inclusiv factorul de creștere a fibroblastelor 21 (FGF21) (26), proteina morfogenetică osoasă 4 (BMP4) (27), BMP7 (28), BMP8b (29), FGF19 (30), factor de diferențiere a creșterii 5 (GDF5) (31), peptide natriuretice (32), prostaglandine (33, 34), factor de creștere endotelial vascular (VEGF) (35), acid β-aminoisobutiric (BAIBA) (36), asemănătoare meteorinei (14) și irisinei (37). Acești factori sunt implicați în controlul cheltuielilor de energie și al greutății corporale prin modularea BAT sau a grăsimii bej. În acest context, dacă factorii secretați de BAT pot contribui la cheltuirea energiei sau pentru a compensa termogeneza BAT defectă prin activarea altor țesuturi termogene, inclusiv a țesutului adipos bej sau alb, este puțin înțeles.

Aici, raportăm că pierderea YY1 în BAT duce la o supresie puternică a expresiei genelor mitocondriale și termogene. În ciuda funcției termogene BAT reduse, șoarecii cu deficit de YY1 sunt protejați împotriva obezității induse de dietă și au activat țesutul adipos bej și alb termogen. Arătăm că YY1 are un control antagonist al genelor BAT, prin faptul că activează gene legate de termogeneza adaptivă prin activarea căii canonice termogene, dar suprimă o serie de proteine ​​secretate, inclusiv FGF21, BMP8b și GDF15, care activează energia corpului întreg cheltuieli.

MATERIALE ȘI METODE

Experimente pe animale.

Toate experimentele și protocoalele au fost aprobate de Comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor de la Dana Farber Cancer Institute sau Beth Israel Deaconess Medical Center. Șoarecii YY1-Ucp1Cre și YY1-AdipoCre au fost generați de animale de reproducție care adăpostesc o alelă YY1 floxată (38) cu șoareci transgenici care exprimă Ucp1 Cre (39) sau respectiv Adiponectin Cre recombinază (40). Pentru experimentele de tip sălbatic de șoarece, șoareci C57BL/6 de 8 săptămâni au fost cumpărați de la Taconic Farms. Șoarecii au fost menținuți pe o dietă standard sau 60% dietă bogată în grăsimi (HFD) (Research Diets) cu cicluri de 12 ore. Pentru experimentele de expunere la rece, șoarecii au fost plasați în incubatoare de 4 ° C sau 30 ° C la momentele indicate, iar temperatura corpului a fost măsurată cu o sondă rectală. Pentru studii metabolice, cheltuielile de energie au fost analizate folosind un sistem cuprinzător de monitorizare a animalelor de laborator (Columbus Instruments). Șoarecii au fost aclimatizați timp de 24 de ore înainte de efectuarea măsurătorilor. S-au efectuat măsurători de imagistică prin rezonanță magnetică (RMN) la șoareci întregi într-un instrument de scanare CITI.

Expresia genelor și analiza Western blot.

ARN-ul total din celule sau țesuturi cultivate a fost purificat folosind TRIzol (Invitrogen) pentru sinteza ADNc (kit ABI de mare capacitate). Expresia relativă a ARNm a fost cuantificată prin PCR cantitativă (qPCR) folosind colorant verde SYBR (ABI) și primerii specifici (datele nu sunt prezentate). Pentru Western blot, lizații de celule întregi au fost preparați cu tampon de test radioimunoprecipitare (RIPA), separat prin SDS-PAGE, și transferați la membranele Immobilon-P (Millipore). Pentru detectarea GDF15 circulant, s-a folosit 1 μl de plasmă pentru SDS-PAGE. Au fost utilizați următorii anticorpi: anti-YY1 (Santa-Cruz), anti-UCP1 (Abcam), anti-NDUFA9 (Abcam), anti-succinat dehidrogenază (anti-SDHA) (Abcam), antiaconitază (Abcam), anti-GDF15 (Abcam), anti-MTCO1 (Abcam), anti-UQCRC2 (Abcam), pCREB (Cell Signaling), CREB total (Cell Signaling) și antitubulin (Millipore).

Coimmunoprecipitații.

Un grup de țesut adipos maro interscapular de la 5 șoareci a fost omogenizat cu un pistil motorizat în 4 ml tampon de izolare nucleară (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM ditiotreitol [DTT], inhibitori de protează complete [ Roche]) și incubat pe gheață timp de 10 min. Nucleele au fost peletizate prin centrifugare la 3.200 × g timp de 5 min și spălate în 4 ml din același tampon înainte de centrifugare la 3.200 × g timp de 5 min. Peletele de nucleu au fost apoi resuspendate în 600 μl de tampon de imunoprecipitare (0,1% NP-40, 150 mM NaCI, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, Inhibitori de protează complete [Roche]). Două sute de micrograme de proteină au fost incubate cu 3 μg de anticorp YY1 (sc1703; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) sau IgG de iepure pentru controale peste noapte la 4 ° C cu rotație. Imunocomplexele au fost precipitate cu margele magnetice de proteină G (DynaBeads; Invitrogen) în timpul unei rotații de 1 oră la 4 ° C. Probele au fost apoi spălate de 5 ori în tampon de imunoprecipitare. Probele au fost fierte în cele din urmă și supernatantele au fost rulate pe SDS-PAGE, inclusiv probe de intrare pentru detectarea Western blot folosind anticorp PGC-1α (Santa Cruz), anticorp YY1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) și lamin B1 (Abcam).

Linia celulară de grăsime brună De2.3 a fost tratată cu dimetil sulfoxid (DMSO) sau 10 μM forskolin la 10 μM timp de 4 ore. Nucleii au fost izolați direct prin incubarea peletelor celulare cu tampon de izolare nucleară. Același protocol a fost utilizat pentru țesutul de grăsime brună pentru a coimmunoprecipita complexul YY1 - PGC-1α.

Analiza histologică.

Țesuturile proaspăt recoltate au fost fixate în paraformaldehidă 4% peste noapte. Înglobarea parafinei, secționarea și colorarea hematoxilinei și eozinei au fost efectuate de către centrul de cercetare a patologiei cercetării cancerului Dana Farber/Harvard.

Acidul gras și oxidarea glutaminei.

Țesutul adipos maro a fost omogenizat Dounce în tampon STE rece (0,25 M zaharoză, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) și centrifugat la 420 × g timp de 10 min. Supernatantul a fost adăugat la 370 μl dintr-un amestec de reacție conținând o concentrație finală de 100 mM zaharoză, 10 mM Tris-HCI, 5 mM KH2PO4, 0,2 mM EDTA, 80 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM l-carnitină, 0,1 mM malat, 0,05 mM coenzima A, 2 mM ATP, 1 mM DTT și soluție de albumină serică de bovină (BSA) -palmitat (0,7% BSA, 500 μM acid oleic, 0,4 μCi [14 C] acid oleic sau [14 C] glutamină) . Probele au fost incubate la 37 ° C timp de 1 oră și reacția a fost oprită prin adăugarea a 200 pl de acid percloric 1 M. Apoi, hârtia Whatman saturată cu 2-feniletilamină a fost plasată sub capacul tubului pentru a prinde CO2 radiomarcat în timpul incubării peste noapte. În cele din urmă, hârtia Whatman a fost plasată într-un lichid de scintilație, iar numărul radioactiv a fost măsurat într-un contor de scintilație.

Consumul de oxigen.

Respirația directă a țesutului ex vivo a fost efectuată folosind un electrod Clark (Strathkelvin Instruments). Țesutul proaspăt izolat a fost tocat în tampon de respirație (piruvat 1,5 mM, glucoză 25 mM, 2% BSA) și plasat în camere de electrod. Rata consumului de O2 a fost normalizată la greutatea țesutului.

Pentru respirația mitocondrială directă din țesutul adipos maro, mitocondriile au fost izolate în tampon STE (0,25 M zaharoză, 5 mM Tris, 2 mM EDTA) și centrifugate timp de 10 minute la 8 500 × g. Peleta a fost resuspendată în tampon STE și centrifugată din nou de două ori la 8.500 × g. Mitocondriile peletate au fost resuspendate în 0,5 ml de tampon STE și s-a măsurat concentrația totală de proteine. Respirometria a fost efectuată folosind platforma XF24-3 de la Seahorse Biosciences așa cum s-a descris anterior (19).

Cultură de celule adipocitare primare.

Fracția vasculară stromală (SVF) a țesutului adipos maro al șoarecilor în vârstă de 6 săptămâni a fost izolată prin digestia colagenazei urmată de două etape alternative de filtrare (folosind strecurătoare de 100 și 40 μM) și centrifugări timp de 5 minute la 500 × g. Apoi celulele au fost placate și diferențiate la confluența cu cocktail adipogen (0,5 mM 3-izobutil-1-metilxantină [IBMX], 1 μM dexametazonă, 1 μM rosiglitazonă, 0,02 μM insulină, 1 nM T3) timp de 48 ore. Celulele au fost menținute în insulină 0,02 μM și T3 1 nM și recoltate în zilele 6-8 postdiferențierea.

Țesutul adipos maro a fost disecat, tăiat în bucăți mici și reticulat în soluție salină tamponată cu formaldehidă - fosfat 1% (PBS) timp de 10 minute; reacția a fost apoi stinsă în glicină 0,125 M. BAT a fost apoi omogenizată în tampon de izolare (250 mM zaharoză, 5 mM Tris, 2 mM EDTA) folosind un pistil motorizat urmat de izolarea cromatinei în tampon conținând 50 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1%, Na-deoxicolat, 0,1% SDS și inhibitori complet de protează (Roche). Probele au fost sonicate într-un Diagenode Bioruptor timp de 5 cicluri de 5 min cu un ciclu de funcționare de 30 s „pornit” și 30 s „oprit”. Probele au fost imunoprecipitate cu anticorpi specifici pentru YY1 (Santa Cruz) și H3K27me3 (Abcam), iar ADN-ul a fost izolat pentru analiza qPCR așa cum s-a descris anterior (25).

Detectarea noradrenalinei plasmatice.

Treizeci de microlitri de plasmă au fost utilizați pentru a măsura noradrenalina plasmatică prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (Rocky Mountain Diagnostics) conform ghidurilor producătorului.

Analize de îmbogățire a matricelor și a setului de gene.

ARN extras din BAT sau țesutul adipos alb subcutanat inghinal (IWAT) a fost utilizat pentru a efectua matrice de gene folosind un mouse 430A 2.0 GeneChip la instalația de bază Microarray de la Dana Farber Cancer Institute. Pentru a genera fișierele de expresie genică (GCT), fișierele CEL au fost utilizate ca intrare pentru modulul Gene Pattern (http://genepattern.broadinstitute.org/) Expression File Creator folosind o medie multiarray robustă (RMA) și normalizarea cuantilă. Pentru analiza de îmbogățire a setului de gene (GSEA), fișierele GCT au fost utilizate ca intrare utilizând software-ul GSEA 2.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea) utilizând parametrii impliciți (41).

Număr de acces la date Microarray.

Numărul de acces la Omnibus pentru expresia genică pentru datele de expresie genică raportate este super seria nr. > GSE68443.

REZULTATE

Ștergerea genetică a YY1 în țesutul adipos duce la protecție împotriva obezității induse de dietă.

adipos

Rumenirea țesutului adipos alb subcutanat la șoarecii YY1 KO hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. (A) Expresia genică a IWAT de la YY1bKO versus șoarecii martor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. (B) Analiza expresiei setului de gene (GSEA) a IWAT de la YY1bKO versus șoareci martori care indică căi catabolice crescute. (C) Analiza Western blot a proteinelor mitocondriale în IWAT de la YY1bKO comparativ cu șoarecii martor pe o dietă bogată în grăsimi. (D) colorarea H&E a secțiunilor transversale IWAT de la YY1bKO față de șoarecii martor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. (E) Consumul de oxigen ex vivo al omogenizaților IWAT de la YY1bKO față de șoarecii martori măsurați de electrodul Clark. (F) Viteza de oxidare a acizilor grași măsurată prin eliberarea a 14 CO2 de la omogenizații IWAT incubați cu acid oleic radiomarcat cu 14 C în șoareci YY1bKO și șoareci de control. Datele sunt reprezentate ca mijloace ± SEM. *, P Fig. 5A și Fig. 1C și andD), D), am efectuat GSEA din țesut adipos visceral de la șoareci de tip sălbatic și YYaKO. Interesant este că expresia mai multor membri ai familiei SLC25 de purtători mitocondriali codați nuclear a fost crescută în EWAT de la șoareci YY1aKO (Fig. 5B). Familia de gene SLC25 codificată în nucleu este implicată într-un import multiplu de substanțe dizolvate în mitocondrii. Interesant, purtătorii de import de aminoacizi (Slc25a22 și Slc25a44), nucleotide (Slc25a33) și carboxilat (Slc25a10) au fost crescuți în EWAT a șoarecilor YY1aKO hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi, așa cum se arată în qPCR în Fig. 5C. În plus, modificările majore ale transcrierilor ARNm legate de aportul de nutrienți (Glut4 și Fabp3) și de utilizarea energiei mitocondriale (Ppar-α, Acot2, Cpt1b și Elovl3) au fost crescute la șoarecii YY1aKO fie la hrana cu conținut ridicat de grăsimi, fie la cea rece. -grupuri expuse (Fig. 5C și andD D).

Factorii secretați legați de cheltuielile de energie sunt crescute în grăsimea brună a șoarecilor YY1-Ucp1 KO.

Luate în ansamblu, aceste rezultate arată că printre genele cu expresie crescută, cele care codifică proteinele secretate în BAT de la șoareci mutanți YY1, Bmpb8 și Gdf15, sunt ținte represive directe ale YY1 menținând H3K27me3 în promotorii lor. Aceste date sugerează că funcția de reprimare a YY1 pe promotorii Bmp8b și Gdf15 ar putea fi atenuată în timpul creșterii cererii de energie. În plus, deficitul de YY1 în BAT a determinat o creștere a expresiei genice a proteinelor secretate, inclusiv expresia genelor FGF21, Neuromedin B, Nesfatin și Angptl6; cu toate acestea, aceste gene nu sunt ținte YY1 directe și sunt controlate prin acțiunea altor țesuturi.

DISCUŢIE

Model. YY1 recrutează PGC-1α și induce termogeneza clasică prin activarea genelor termogene mitocondriale și canonice în grăsimea brună. Cu toate acestea, YY1 joacă un rol direct de supresor în controlul genelor termogene alternative, inclusiv Bmp8b și Gdf15, și are control indirect asupra genelor Fgf21, Angptl6, Neuromedin B și Nesfatin legate de cheltuielile de energie. Cu un aport caloric excesiv și pierderea YY1, acești factori sunt secretați de BAT, cresc termogeneza în celulele grase bej și albe și protejează împotriva obezității induse de dietă.

În rezumat, am descoperit o funcție antagonică a factorului de transcripție YY1 în BAT prin activarea genelor termogene și prin suprimarea genelor care codifică factorii secretați asociați cu cheltuielile de energie. Componentele care vizează această cale pot fi utile terapeutic pentru tratarea obezității sau a bolilor metabolice asociate.

MULȚUMIRI

Mulțumim membrilor laboratorului Puigserver pentru sfaturi și discuții fructuoase și tehnicienilor BIDMC Animal Research Facility pentru îngrijirea șoarecilor. Mulțumim lui Linus T. Tsai și Evan D. Rosen pentru că ne-au furnizat linia de șoarece Ucp1-Cre.

Aceste studii au fost susținute de NIH/NIDDK RO1DK081418 (P.P.) și de burse postdoctorale: EMBO pe termen lung (F.V.), NIH-1F32DK105679-01 (M.S.S.) și DFG, Fundația Germană de Cercetare HA 7246/1-1 (M.H.).

F.V. a proiectat și a efectuat toate experimentele și a scris manuscrisul. MS a asistat la colectarea de organe de șoarece și a revizuit manuscrisul. M.H. a contribuit la experimentele efectuate în timpul procesului de revizuire. S.M.B. a revizuit manuscrisul și a oferit sfaturi conceptuale și reactivi. D.M. asistat cu experimentarea genotipării șoarecilor și a consumului de oxigen tisular. J.B. a revizuit manuscrisul și a oferit sfaturi conceptuale și reactivi. P.P. a conceput studiul, a oferit sfaturi conceptuale, a supervizat proiectul și a scris și revizuit manuscrisul.

Declarație de finanțare

Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și interpretarea datelor sau decizia de a trimite lucrarea spre publicare.